溫建立，劉勝華

（貴州省遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，貴州 遵義 563002）

白細(xì)胞介素 13（interleukin-13，IL-13）是由活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)過(guò)敏性炎癥的重要細(xì)胞因子［1，2］。IL-13通過(guò)結(jié)合二聚體受體激活下游信號(hào)通路，在支氣管哮喘（以下簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）發(fā)病中起重要作用。它可誘發(fā)氣道高反應(yīng)性（airway high reactivity，AHR）IgE增高及黏液分泌增多等變態(tài)反應(yīng)，同時(shí)與杯狀細(xì)胞增生和上皮細(xì)胞下纖維性化相關(guān)。研究表明，抑制IL-13可有效緩解哮喘癥狀。本研究擬采用B細(xì)胞表位技術(shù)制備抗IL-13抗體，探討抗IL-13抗體在哮喘治療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

新西蘭大耳白兔和雄性BALB/C小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心；匙孔戚血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、雞卵蛋白（ovalbumin，OVA）、弗氏完全佐劑及弗式不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG和ECL顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司；細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳晶美公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 抗原表位分析：利用Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)和抗體設(shè)計(jì)軟件（Dragonfly）分析IL-13蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、親水性、抗原性及表面可及性等特點(diǎn)，選擇IL-13特異的片段作為擬合成的多肽，用于制備針對(duì)全蛋白的多克隆抗體。

1.2.2 免疫原及抗體純化凝膠制備：IL-13多肽片段由北京三博生物科技有限公司合成（純度＞98%），在合成多肽的C末端加一半胱氨酸用于與KLH的耦聯(lián)。將IL-13多肽片段溶于PBS緩沖液中，加入已溶解的KLH蛋白，0.3%的戊二醛耦聯(lián)2 h，甘氨酸溶液終止反應(yīng)［3］。IL-13片段與活化凝膠耦聯(lián)：連接緩沖液（50 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA）溶解合成的 IL-13多肽，加入凝膠混合30 min，以封閉液封閉30 min完成抗體純化凝膠制備。

1.2.3 IL-13多克隆抗體制備：通過(guò)皮下多點(diǎn)注射方式免疫新西蘭大耳白兔，多肽-KLH耦聯(lián)物免疫劑量為100 μg/次。每2周免疫1次，共免疫4次。其中，首次免疫與弗氏完全佐劑乳化混勻，第2～4次免疫與弗式不完全佐劑乳化混勻。耳緣靜脈采血測(cè)定抗體效價(jià)，符合要求時(shí)，頸動(dòng)脈取血，分離抗血清，保存于-20℃。

1.2.4 IL-13多克隆抗體純化：采用親和層析法。抗血清經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀，PBS透析后與肽連接凝膠4℃混合過(guò)夜，裝柱。以甘氨酸溶液洗脫2～3次，合并收集的洗脫液，經(jīng)過(guò)PBS透析后，BCA法測(cè)定蛋白濃度。純化的抗體分裝保存于-20℃。

1.2.5 抗體效價(jià)及特異性檢測(cè)：通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)。多肽-KLH耦聯(lián)物最終包被濃度為 0.5 μg/mL，包被量 100 μL/孔；5%脫脂奶粉 37 ℃封閉2 h，OBST洗滌3次，每次3～5 min；加入倍比稀釋的抗體孵育1 h，PBST洗滌；二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37℃反應(yīng)30 min；PBST充分洗滌后顯色5～10 min，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。以S/N>2.1為陽(yáng)性值。

1.2.6 動(dòng)物哮喘模型建立及分組：取6～8周齡雄性BALB/c小鼠，每只小鼠于第1天和第8天腹腔注射30 μg OVA（溶于 100 μL PBS）和等體積氫氧化鋁，以后每隔1周霧化吸入5%OVA，20 min/次，共4次。根據(jù)哮喘激發(fā)前尾靜脈注射抗體不同將小鼠分為：（1）兔IgG組：霧化吸入前1 h靜脈注射兔IgG（20 μg/只）；（2）IL-13抗體組：霧化吸入前 1 h靜脈注射兔 IL-13 多克隆抗體（20 μg/只）；（3）PBS 組：霧化吸入前1 h靜脈注射等量PBS緩沖液。陰性對(duì)照組用生理鹽水代替OVA進(jìn)行腹腔注射。

1.2.7 支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子水平檢測(cè)：給予小鼠氣管插管，用預(yù)冷的PBS緩沖液灌洗肺組織2次，每次1 mL，收集合并灌洗液，4℃1 000 r/min離心5 min，分離上清和細(xì)胞沉淀。用0.8 mL Hank液重懸細(xì)胞沉淀，測(cè)定細(xì)胞總數(shù)。涂片，Wright-Giemsa染色，細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。眼眶采血，離心分離血清，EILSA法測(cè)定小鼠血清中細(xì)胞因子水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.8 肺組織切片檢查：取小鼠肺組織，10%甲醛緩沖液浸泡48 h，制成石蠟包埋切片，嗜依紅和蘇木精染色后觀察肺組織病理變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 多肽序列選擇

通過(guò)軟件對(duì)IL-13蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性、抗原性和表面可及性進(jìn)行綜合分析，IL-13蛋白第12～26氨基酸序列LTKELIEELSNITQ可作為IL-13的抗原表位。

2.2 多肽抗體效價(jià)、純度及特異性檢測(cè)結(jié)果

將合成多肽與KLH耦聯(lián)并免疫新西蘭大耳白兔，ELISA法免疫3次檢測(cè)血清抗體效價(jià)達(dá)到1︰104。免疫周期結(jié)束后，采用親和層析方法純化抗體，抗體濃度達(dá)到3.25 g/mL；純化后抗體效價(jià)達(dá)到1︰105。

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞因子檢測(cè)

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示：經(jīng)OVA誘導(dǎo)哮喘后，IL-13組、兔IgG組和PBS組小鼠的BALF中細(xì)胞數(shù)量顯著高于陰性對(duì)照組小鼠（P<0.01）；IL-13抗體組的BALF中細(xì)胞數(shù)量少于PBS組和兔IgG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而兔IgG組和PBS組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示IL-13參與哮喘發(fā)生，IL-13中和抗體可抑制哮喘病程發(fā)展。

表1 小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)（n=8）Tab.1 Categorization and count of leucocytes in BALF of mice（n=8）

通過(guò)ELISA法測(cè)定BALF中細(xì)胞因子，結(jié)果如表2所示：與陰性對(duì)照組相比，PBS組和兔IgG組細(xì)胞因子 IL-4、IL-5顯著升高（P<0.01），而 γ-IFN 顯著降低（P<0.01）；IL-13抗體組BALF中IL-4、IL-5顯著低于PBS組和兔IgG組（P<0.05），γ-IFN明顯高于PBS組和兔IgG組（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了IL-13抗體的中和作用。

表2 小鼠BALF中細(xì)胞因子含量（pg/mL，n=8）Tab.2 Cytokine levels of BALF in mice（pg/mL，n=8）

2.4 肺組織病理檢查結(jié)果

病理檢查結(jié)果如圖1所示：OVA誘導(dǎo)哮喘組（IL-13組、兔IgG組、PBS組）與陰性對(duì)照組比較，支氣管和血管炎癥及肺氣腫程度明顯。IL-13抗體組小鼠支氣管和肺泡炎癥較兔抗IgG組和PBS組明顯減輕。

3 討論

支氣管哮喘是由肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)和氣道非特異性炎性反應(yīng)。目前主要應(yīng)用激素治療哮喘，但激素治療有一定的缺陷，如容易產(chǎn)生依賴(lài)性和耐藥性。同時(shí)，激素作用的非特異性也限制了其應(yīng)用。因此，尋找新的治療途徑成為哮喘研究的熱點(diǎn)。

研究認(rèn)為，Th2細(xì)胞因子IL-13與哮喘病情發(fā)展密切相關(guān)［4］，它能促進(jìn)趨化因子產(chǎn)生，上皮下纖維化，杯狀細(xì)胞增生及氣道黏液增多，并激活中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，參與氣道重建。隨著人們對(duì)IL-13研究的深入，IL-13在哮喘中的作用日益受到人們的重視，探索抑制IL-13的方法可為治療哮喘提供新的途徑。研究表明，阻斷IL-13可緩解哮喘癥狀。Lively等［5］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)IL-13 RNA干擾可減弱氣道炎癥和氣道高反應(yīng)，Lee等［6］利用化學(xué)修飾干擾RNA也得到類(lèi)似結(jié)果，Bree等［7］通過(guò)IL-13抗體阻斷IL-13可改善食蟹猴哮喘癥狀，Ma等［8］利用IL-13肽段制備的疫苗能夠減輕氣道炎癥狀。

本研究通過(guò)序列分析選擇了IL-13特有的抗原表位，與KLH耦聯(lián)制備抗IL-13抗體?？贵w效價(jià)達(dá)到1︰105，通過(guò)親和層析方法獲得的抗體純度達(dá)到80%以上，且該抗體能特異識(shí)別IL-13全蛋白，而不與其他蛋白發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明通過(guò)抗原表位制備的抗體具有較高特異性。用制備的抗體治療小鼠哮喘模型，結(jié)果表明該抗體能有效減輕IL-13引起的炎性反應(yīng)，說(shuō)明制備的抗體能夠中和IL-13，緩解哮喘癥狀。

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