劉維新，張紳，任益，桑立軒，顧壽智

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，沈陽 110001；2.聖隷クリストファー大學(xué)，浜松 4338558，日本）

惡性腫瘤是當(dāng)今導(dǎo)致世界人類死亡的主要原因之一［1］，其中約1/4的患者其病因及發(fā)病機(jī)制與慢性炎癥相關(guān)［2，3］。炎性腸病的年發(fā)病率約為2.2/10萬［4］，而炎性腸病患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)較非炎性腸病者大大增加，患炎性腸病8～10年后結(jié)直腸癌的發(fā)病率每年以0.5%～1%遞增，30年后高達(dá)18%［5］。盡管與炎性腸病相關(guān)的結(jié)直腸癌僅占全部結(jié)直腸癌的1%～2%，但卻是造成炎性腸病患者死亡的主要原因［6］。潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎性腸病中常見的一個(gè)類型，反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥常進(jìn)展為結(jié)直腸惡性腫瘤，而惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展與其血管生成密切相關(guān)。新近研究表明，血管生成素（angiopoietin，Ang）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體 Flk-1以及直接或間接調(diào)控VEGF表達(dá)的缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）等均是參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤血管生成的重要因素［7］。葡聚糖硫酸鈉（dioctyl sodium sulfosuccinate，DSS）多循環(huán)飲用可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生與人類臨床和病理相似的UC［8］，1，2-二甲肼（DMH）/DSS聯(lián)合法可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生UC相關(guān)性結(jié)直腸癌 （ulcerative colitis-associated colorectal cancer，UCACRC），可成功模擬炎性腸病誘發(fā)結(jié)直腸癌的全過程［9］。本文利用以上2種方法建立UC及UCACRC 小鼠模型，檢測 Ang-2、VEGF、Flk-1、HIF在UC組織、UCACRC組織及正常結(jié)腸組織中的表達(dá)水平，探討其與血管生成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用雄性5～6周齡Balb/c小鼠66只，體質(zhì)量在25～32 g之間，由中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，恒溫（23±2）℃，恒濕50%±10%，晝夜循環(huán)。

1.2 主要試劑

1.2.1 造模試劑：分子量為5 000的DSS，購自Sigma公司；DHM，購自Sigma公司。

1.2.2 免疫組化法試劑：鼠抗鼠VEGF單克隆抗體、兔抗鼠Flk-1多克隆抗體、S-P免疫組化通用型試劑盒和DAB顯色劑，購自北京中山生物試劑公司；鼠抗鼠HIF-1a單克隆抗體，購自武漢博士德生物試劑公司；羊抗鼠Ang-2多克隆抗體，購自泉州市藍(lán)圖生物科技有限公司；兔抗鼠CD34單克隆抗體，購自北京博楓科生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模及分組：配制DMH溶液：將DMH溶于生理鹽水中，配制其終濃度為20 mg/kg，用1 mmol/L NaHCO3溶液調(diào)整pH值至6.5～7.0之間。配制DSS飲用水：將分子量為5 000的DSS溶于蒸餾水中，配置成5%的DSS溶液。隨機(jī)將小鼠分為3組：應(yīng)用DSS誘導(dǎo)法建立UC小鼠模型（UC組，n=23），應(yīng)用DMH/DSS聯(lián)合法建立UCACRC小鼠模型（UCACRC組，n=23），同時(shí)設(shè)立對照組（n=20）。UC 組小鼠以自由飲用5%的DSS飲用水1周+自由飲用蒸餾水1周為1個(gè)循環(huán)周期；UCACRC組小鼠以腹腔注射法予以20 mg/kg DMH 1次，后自由飲用5%的DSS飲用水1周，繼而自由飲用蒸餾水1周，以上過程為1個(gè)循環(huán)周期；UC組及UCACRC組均重復(fù)9個(gè)循環(huán)周期。對照組予以蒸餾水自由飲用，不作任何處理。

1.3.2 標(biāo)本采集：分別于第1個(gè)循環(huán)周期、第5個(gè)循環(huán)周期于各組隨機(jī)抽取5只小鼠處死，于第9個(gè)循環(huán)周期處死各組剩余小鼠。將每例的整段結(jié)腸取出，測量其長度，后沿縱軸切開，選取紅腫糜爛、潰瘍或腫瘤較明顯處的病變腸段，分為2份。第1份用生理鹽水沖凈后，固定于10%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、制作組織切片、常規(guī)HE染色后封片，于光鏡下觀察結(jié)腸組織病理改變的情況；第2份采用S-P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，具體步驟按操作說明書進(jìn)行，用以檢測3組小鼠結(jié)腸組織中Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1的表達(dá)水平。

1.3.3 造模指標(biāo)檢測

1.3.3.1 疾病活動(dòng)指數(shù)的評估 每日記錄小鼠的體質(zhì)量、大便性狀和隱血情況。體質(zhì)量無下降、大便正常、隱血陰性各記0分；體質(zhì)量下降＜5%、大便松散、隱血陰性各記1分；體質(zhì)量下降5%～10%、大便松散、隱血陽性各記2分；體質(zhì)量下降10%～15%，大便稀便、隱血陽性計(jì)3分；體質(zhì)量下降＞15%、稀便、肉眼血便計(jì)4分。將三者的評分相加，記為每只小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)，以評估疾病活動(dòng)情況。

1.3.3.2 病理組織學(xué)損傷評分 在光鏡下觀察結(jié)腸組織切片。無潰瘍、無炎癥、無肉芽腫、無纖維化、無病變各記0分；小潰瘍＜3 mm、輕度炎癥、有肉芽腫、病變局限于黏膜下層各記1分；大潰瘍＞3 mm、重度炎癥病變深度達(dá)肌層、重度纖維化各記2分。合計(jì)總分，算平均值。

1.3.3.3 不典型增生評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 按照Morson等［10］描述的標(biāo)準(zhǔn)將不典型增生分為低度和高度不典型增生；癌變分為原位癌（癌細(xì)胞浸潤至黏膜層或黏膜下層）和進(jìn)展期癌（癌細(xì)胞浸潤至肌層及以外）。

1.3.4 S-P法結(jié)果判定：Ang-2蛋白主要定位于胞質(zhì)，VEGF和Flk-1蛋白主要定位于胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜，HIF-1a蛋白主要定位于胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，以上四者經(jīng)S-P法免疫組化染色，DAB液顯色后均以出現(xiàn)棕黃色顆粒為表達(dá)陽性。參照Sinicrope的標(biāo)準(zhǔn)［11］進(jìn)行半定量積分法判斷結(jié)果。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞的比例，非癌組織則計(jì)數(shù)著色區(qū)100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞的比例。記分如下：（1）按陽性細(xì)胞百分比記分：平均陽性細(xì)胞的比例<5%，記為0分；5%～25%，記為1分；26%～50%，記為2分；51%～75%，記為3分；>75%，記為4分。（2）按著色強(qiáng)度記分：呈淡黃色者為弱染色，記為1分；呈黃色者為中等染色，記為2分；呈棕黃色者為強(qiáng)染色，記為3分。2個(gè)記分的乘積：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽性（+）；5～8分為中度陽性（++）；9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及疾病活動(dòng)指數(shù)評分

表1 第1、5、9個(gè)循環(huán)周期末3組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評分、結(jié)腸長度及病理組織學(xué)評分Tab.1 Disease activity index，length of colon，and pathohistological index of 3 groups of mice at the end of 1，5，and 9 cycles

UC組及UCACRC組小鼠在第1個(gè)循環(huán)周期的第3天開始出現(xiàn)精神萎靡、懶動(dòng)、食量減少、體毛凌亂等癥狀，第4天有1只小鼠出現(xiàn)大便潛血陽性，第5天有3只小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，其中2只小鼠出現(xiàn)大便次數(shù)增多、質(zhì)稀、肉眼血便。至第1個(gè)循環(huán)周期末2組小鼠中出現(xiàn)大便松散、稀便、隱血陽性、肉眼血便及膿血便者逐漸增多。改為自由飲用蒸餾水后第1～2天仍可見血便，后血便及腹瀉情況逐漸緩解。第5個(gè)循環(huán)周期開始后第3天即有5只小鼠復(fù)現(xiàn)大便隱血陽性，2只復(fù)現(xiàn)肉眼血便，且停止飲用DSS飲用水后癥狀持續(xù)時(shí)間較前1個(gè)循環(huán)延長。第9個(gè)循環(huán)開始后第2天2組中即有所有小鼠出現(xiàn)稀便、肉眼血便、體質(zhì)量下降，改為自由飲用蒸餾水后5 d仍有腹瀉及便血癥狀。對照組小鼠精神及活動(dòng)正常，食量無明顯改變，體毛柔順，大便性狀及頻次正常。第1、5、9個(gè)循環(huán)周期末各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評分見表1。

2.2 光鏡下結(jié)腸病理組織學(xué)評估

UCACRC組及UC組：在第1個(gè)循環(huán)周期末處死的小鼠中結(jié)腸組織有明顯的充血水腫，部分黏膜上皮損傷脫落，伴有不同程度的腺體結(jié)構(gòu)消失。第5個(gè)循環(huán)周期末處死的小鼠中發(fā)現(xiàn)多灶性小潰瘍，部分組織的漿膜層出現(xiàn)息肉狀改變，固有腺體萎縮。第9個(gè)循環(huán)周期末處死的小鼠中，UC組可見黏膜廣泛壞死、糜爛，炎性細(xì)胞浸潤全層；UCACRC組出現(xiàn)不同程度的不典型增生和癌變的表現(xiàn)，如細(xì)胞出現(xiàn)核大深染、核形不規(guī)則、核分裂像增多、核質(zhì)比例增大等，多見于結(jié)腸的遠(yuǎn)端；對照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列規(guī)則，無充血水腫及糜爛潰瘍。第1、5、9個(gè)循環(huán)周期末3組小鼠病理組織學(xué)損傷評分及結(jié)腸長度見表1。第9個(gè)循環(huán)周期末UCACRC組的不典型增生及癌變率高于對照組及UC組（P＜0.05），UC組不典型增生率高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 第9個(gè)循環(huán)周期末3組小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生情況Tab.2 Incidence of colorectal cancer of colon at the end of 9 cycles

2.3 S-P法檢測結(jié)果

2.3.1 不同類型的結(jié)腸組織中血管生成相關(guān)因子的表達(dá)：4種血管生成相關(guān)因子的陽性表達(dá)率在UCACRC組織和UC組織中均在62%以上，在正常結(jié)腸組織中均不高于10%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而且UCACRC組織和UC組織相比，除HIF在UCACRC組表達(dá)較UC組升高（P＜0.05）外，Ang-2、VEGF、Flk-1的陽性表達(dá)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表 3。

表3 9個(gè)循環(huán)周期后血管生成相關(guān)因子在不同類型結(jié)腸組織中的表達(dá)Tab.3 Expression of angiogenesis in the colon tissue of different groups at the end of 9 cycles

2.3.2 UC組不同時(shí)期的結(jié)腸黏膜中血管生成相關(guān)因子的表達(dá)：觀察第1、5、9個(gè)循環(huán)周期末UC組小鼠結(jié)腸組織中4種血管生成相關(guān)因子Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，4種血管生成相關(guān)因子的陽性表達(dá)率隨實(shí)驗(yàn)周期的增加而增大，第9個(gè)循環(huán)周期末的陽性表達(dá)率與第1個(gè)循環(huán)周期末相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與第5個(gè)循環(huán)周期末相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且第5個(gè)循環(huán)周期末與第1個(gè)循環(huán)周期末相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 血管生成相關(guān)因子在UC組小鼠不同時(shí)期的結(jié)腸組織中的表達(dá)Tab.4 Expression of angiogenesis in the colon tissue of UC group in different cycles

3 討論

當(dāng)今UC的發(fā)病率日益增高，其相關(guān)性結(jié)腸癌的發(fā)病率也隨之上升，UC相關(guān)性癌變逐漸成為當(dāng)下醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［12］。此種癌變在炎性腸病中具有高致死率和低發(fā)生率的特點(diǎn)，所以在臨床收集多個(gè)病例難度較大，對其主要的研究手段為建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，模擬UC發(fā)生癌變的過程。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用DSS誘導(dǎo)法建立UC小鼠模型，應(yīng)用DMH/DSS聯(lián)合法建立UCACRC小鼠模型，結(jié)果顯示單純使用DSS可有效建立UC模型小鼠，但該組發(fā)生低度不典型增生的概率僅為15.38%（2/13），且未發(fā)現(xiàn)癌變者。加用DMH者，即采用DMH/DSS聯(lián)合法處理的小鼠，多個(gè)循環(huán)后發(fā)生不典型增生和癌變的概率明顯提高，可達(dá)92.31%（12/13）。由此我們可以認(rèn)為DMH/DSS多個(gè)循環(huán)聯(lián)合應(yīng)用可以建立較理想的UCACRC小鼠。通過以上2種造模方法，我們可以初步建立UC及其相關(guān)癌變的動(dòng)物模型，從而可對人類UC及其相關(guān)癌變的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制進(jìn)行研究，研發(fā)相應(yīng)的治療藥物，預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

UC特別是其相應(yīng)癌變的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與血管的新生密切相關(guān)。正常情況下，體內(nèi)血管的生長與抑制處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦失衡就會(huì)導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生［13］。炎癥及癌變過程中血管的新生主要依賴于各種血管生成相關(guān)因子的調(diào)節(jié)，Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1為常見的4種血管生成相關(guān)因子。本實(shí)驗(yàn)在成功建立動(dòng)物模型后對以上4種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。通過S-P免疫組化方法檢測以上四者在結(jié)腸炎癥組織、癌變組織及正常組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1在UC組織、UCACRC組織中呈高表達(dá)，其陽性率明顯高于正常結(jié)腸組織（P＜0.05），且通過比較其在UC組第1個(gè)周期末、第5個(gè)周期末、第9個(gè)周期末3個(gè)時(shí)期的陽性表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)隨著實(shí)驗(yàn)周期增加，四者的表達(dá)水平均有所增高。

綜上所述，采用DSS誘導(dǎo)法及DMH/DSS聯(lián)合法可建立UC及UCACRC小鼠模型，成功模擬結(jié)腸的正常組織—炎癥組織—不典型增生—癌變的發(fā)展過程。血管生成相關(guān)因子Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1在UC及UCACRC的血管生成中起重要作用，與炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。特別是HIF在UCACRC中生成表達(dá)較UC組升高，表明炎癥發(fā)生時(shí)常造成組織缺血及缺氧，在有致癌因素存在時(shí)加重組織異常增生，最終導(dǎo)致組織的惡變。目前血管生成相關(guān)因子的作用越來越受到重視，針對抗血管生成藥物及相應(yīng)治療的探討已成為醫(yī)學(xué)科研的熱點(diǎn)。研究各種血管生成相關(guān)因子在UC及其相應(yīng)癌變中的表達(dá)，有助于進(jìn)一步了解結(jié)腸炎—癌改變的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)為抗血管生成治療提供有力依據(jù)。

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