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布洛芬抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠一氧化氮生成的機(jī)制研究

2013-09-07 09:14王春雷張燁蔡開霞王斯琪
關(guān)鍵詞:布洛芬肺纖維化孵育

王春雷,張燁,蔡開霞,王斯琪

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科,沈陽 110001)

氧化應(yīng)激反應(yīng)在肺纖維化的發(fā)病中起重要作用,其中核因子 κB(nuclear factor-κB,NF-κB)作為重要的細(xì)胞因子、黏附分子及炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子,參與急性肺損傷的發(fā)?。?]。研究表明,肺纖維化中可見 NF-κB 的激活[2,3]。NF-κB 在內(nèi)、外源性刺激,如射線、化療藥物、活性氧等的參與下,作用于肺巨噬細(xì)胞、支氣管肺泡上皮細(xì)胞等細(xì)胞后誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶 (inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA的表達(dá),催化L-精氨酸產(chǎn)生過量一氧化氮(nitric oxide,NO)。iNOS和NO對(duì)肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[4,5]。我們的前期研究證實(shí):博萊霉素引起的肺纖維化中,NO表達(dá)明顯增加,而布洛芬可抑制NO的表達(dá),但其機(jī)制并不清楚。本研究擬探討博萊霉素是否可引起小鼠肺組織中iNOS和NF-κB上調(diào)及布洛芬對(duì)其產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;博萊霉素購自哈爾濱博萊制藥有限公司;布洛芬購自煙臺(tái)第二制藥廠;NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所;NF-κB p50和p65多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;抗iNOS抗體購自美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及分組:取健康雄性C57BL/6小鼠 50只,隨機(jī)分為對(duì)照組(A)、模型組(B)、布洛芬 5 mg/kg(C)、10 mg/kg(D)、20 mg/kg(E)治療組,每組10只。10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉小鼠后,用1 mL注射器吸取博萊霉素溶液(生理鹽水配制3 mg/kg)氣管快速注射后,將小鼠垂直放置,旋轉(zhuǎn)3周,使博萊霉素均勻分布于肺部,縫合傷口,讓小鼠自然清醒。A組注射同容積的生理鹽水。C、D、E組注射博萊霉素1 d后,每天分別腹腔注射相應(yīng)劑量的布洛芬(生理鹽水配制)進(jìn)行治療,連續(xù)28 d。

1.2.2 血清NO含量檢測:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死小鼠(每組各5只),腹主動(dòng)脈采血,4 000 r/min離心10 min,收集血清,用NO化學(xué)法試劑盒檢測小鼠血清中NO含量。

1.2.3 肺組織NF-κB的檢測:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死小鼠(每組各5只)。取支氣管、部分肺組織凍存于-80℃?zhèn)溆?。采?步法免疫組織化學(xué)法檢測:用3%H2O2孵育肺組織超薄切片10 min。加一抗(1︰50兔抗NF-κB p65亞單位的抗體和1︰50兔抗NF-κB p50亞單位的抗體),室溫孵育2 h,PBS沖洗,滴加試劑1,室溫孵育20 min;PBS液沖洗,滴加二抗,室溫孵育20 min。以細(xì)胞核染成棕褐色者為陽性細(xì)胞。每張病理切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)其中陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.2.4 Western blot法檢測各組肺組織中iNOS蛋白表達(dá)水平:取各組小鼠肺組織,RIPA裂解液裂解組織,BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定,取20 μg等量蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%SDS-PAGE),轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%蛋白液洗膜3次。用脫脂奶粉封閉1 h,分別加入兔抗鼠單克隆抗體anti-iNOS(1︰800)和 β-actin(1︰1 500),4℃孵育過夜,洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1︰2 000)。ECL顯色,凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清NO含量的比較

與對(duì)照組[(1.646±0.44)μmol/g]比較,模型組小鼠血清 NO 含量[(5.500±0.87)μmol/g]顯著增加(P<0.01)。布洛芬5 mg/kg治療組血清NO含量[(4.064±0.64)μmol/g]無明顯變化,而布洛芬 10 mg/kg治療組[(2.174±0.51)μmol/g]、20 mg/kg治療組[(1.927±0.35)μmol/g]血清 NO 含量明顯降低(P<0.05,P<0.01),提示布洛芬可緩解肺纖維化所引起的NO增高。而且布洛芬20 mg/kg治療組的血清NO明顯低于5 mg/kg和10 mg/kg治療組,說明血清NO含量與布洛芬劑量有一定關(guān)系。相關(guān)分析顯示NO下降水平與布洛芬劑量呈負(fù)相關(guān)(y=-1.260 9x+6.568 5,R2=0.932 7),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組肺組織NF-κB含量的比較

如表1所示:與對(duì)照組比較,模型組肺組織NF-κB含量顯著增加(P<0.01)。布洛芬5 mg/kg治療組肺組織NF-κB含量無明顯變化,而布洛芬10 mg/kg和20 mg/kg治療組肺組織NF-κB含量明顯降低(P<0.05,P<0.01),而且布洛芬20 mg/kg和10 mg/kg治療組的NF-κB明顯低于布洛芬5 mg/kg治療組。說明布洛芬抑制肺纖維化引起的NO增高與下調(diào)NF-κB 有關(guān)。

表1 各組肺組織NF-κB的比較(%)Tab.1 Comparison of NF-κB expression in the lung tissues from different groups(%)

2.3 肺組織中iNOS蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果(圖1)顯示:與正常對(duì)照組比較,模型組肺組織iNOS表達(dá)明顯增加(P<0.01),布洛芬5mg/kg治療組無明顯變化,而布洛芬10mg/kg、20 mg/kg治療組則明顯降低(P<0.05,P<0.01),且布洛芬20 mg/kg、10 mg/kg治療組iNOS明顯低于布洛芬5 mg/kg治療組。

3 討論

NO作為一種生物信使分子和細(xì)胞毒性效應(yīng)分子,參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),具有舒張動(dòng)脈、降低血小板黏滯性和抗炎作用,但過量NO及其代謝產(chǎn)物則可導(dǎo)致機(jī)體損傷。研究表明,肺內(nèi)NO的大量生成可能是促使肺纖維化形成的因素之一[4],但其機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果表明:博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化NF-κB表達(dá)上調(diào),上調(diào)的NF-κB可能通過促進(jìn)iNOS的轉(zhuǎn)錄和翻譯增加其蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)NO的生成,而布洛芬則可明顯抑制上述反應(yīng),起到抑制纖維化的作用。

博萊霉素引起的鼠肺纖維化是公認(rèn)的肺纖維化模型。目前認(rèn)為,NO在肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展,特別是肺泡炎階段起重要作用[6,7]。其可能的機(jī)制為:(1)肺纖維化時(shí)產(chǎn)生的NO可擴(kuò)張微血管,增加毛細(xì)血管后微靜脈的滲出,加重炎癥和組織水腫;(2)通過影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物引起細(xì)胞毒作用[8];(3)可能引起肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞的增殖和調(diào)亡,參與肺纖維化的形成[9,10]。布洛芬可抑制NO的大量產(chǎn)生,抑制肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)布洛芬可通過抑制NF-κB的表達(dá)從而下調(diào)iNOS的表達(dá)水平,從而降低NO水平。本研究結(jié)果為臨床治療肺纖維化提供了一種新的治療途徑。

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