王春雷，張燁，蔡開霞，王斯琪

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，沈陽 110001）

氧化應(yīng)激反應(yīng)在肺纖維化的發(fā)病中起重要作用，其中核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作為重要的細(xì)胞因子、黏附分子及炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，參與急性肺損傷的發(fā)?。?］。研究表明，肺纖維化中可見 NF-κB 的激活［2，3］。NF-κB 在內(nèi)、外源性刺激，如射線、化療藥物、活性氧等的參與下，作用于肺巨噬細(xì)胞、支氣管肺泡上皮細(xì)胞等細(xì)胞后誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA的表達(dá)，催化L-精氨酸產(chǎn)生過量一氧化氮（nitric oxide，NO）。iNOS和NO對(duì)肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展起重要作用［4，5］。我們的前期研究證實(shí)：博萊霉素引起的肺纖維化中，NO表達(dá)明顯增加，而布洛芬可抑制NO的表達(dá)，但其機(jī)制并不清楚。本研究擬探討博萊霉素是否可引起小鼠肺組織中iNOS和NF-κB上調(diào)及布洛芬對(duì)其產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；博萊霉素購自哈爾濱博萊制藥有限公司；布洛芬購自煙臺(tái)第二制藥廠；NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所；NF-κB p50和p65多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；抗iNOS抗體購自美國R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及分組：取健康雄性C57BL/6小鼠 50只，隨機(jī)分為對(duì)照組（A）、模型組（B）、布洛芬 5 mg/kg（C）、10 mg/kg（D）、20 mg/kg（E）治療組，每組10只。10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉小鼠后，用1 mL注射器吸取博萊霉素溶液（生理鹽水配制3 mg/kg）氣管快速注射后，將小鼠垂直放置，旋轉(zhuǎn)3周，使博萊霉素均勻分布于肺部，縫合傷口，讓小鼠自然清醒。A組注射同容積的生理鹽水。C、D、E組注射博萊霉素1 d后，每天分別腹腔注射相應(yīng)劑量的布洛芬（生理鹽水配制）進(jìn)行治療，連續(xù)28 d。

1.2.2 血清NO含量檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠（每組各5只），腹主動(dòng)脈采血，4 000 r/min離心10 min，收集血清，用NO化學(xué)法試劑盒檢測小鼠血清中NO含量。

1.2.3 肺組織NF-κB的檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠（每組各5只）。取支氣管、部分肺組織凍存于-80℃?zhèn)溆?。采?步法免疫組織化學(xué)法檢測：用3%H2O2孵育肺組織超薄切片10 min。加一抗（1︰50兔抗NF-κB p65亞單位的抗體和1︰50兔抗NF-κB p50亞單位的抗體），室溫孵育2 h，PBS沖洗，滴加試劑1，室溫孵育20 min；PBS液沖洗，滴加二抗，室溫孵育20 min。以細(xì)胞核染成棕褐色者為陽性細(xì)胞。每張病理切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)其中陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.2.4 Western blot法檢測各組肺組織中iNOS蛋白表達(dá)水平：取各組小鼠肺組織，RIPA裂解液裂解組織，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定，取20 μg等量蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（12%SDS-PAGE），轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%蛋白液洗膜3次。用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗鼠單克隆抗體anti-iNOS（1︰800）和 β-actin（1︰1 500），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1︰2 000）。ECL顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清NO含量的比較

與對(duì)照組［（1.646±0.44）μmol/g］比較，模型組小鼠血清 NO 含量［（5.500±0.87）μmol/g］顯著增加（P<0.01）。布洛芬5 mg/kg治療組血清NO含量［（4.064±0.64）μmol/g］無明顯變化，而布洛芬 10 mg/kg治療組［（2.174±0.51）μmol/g］、20 mg/kg治療組［（1.927±0.35）μmol/g］血清 NO 含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），提示布洛芬可緩解肺纖維化所引起的NO增高。而且布洛芬20 mg/kg治療組的血清NO明顯低于5 mg/kg和10 mg/kg治療組，說明血清NO含量與布洛芬劑量有一定關(guān)系。相關(guān)分析顯示NO下降水平與布洛芬劑量呈負(fù)相關(guān)（y=-1.260 9x＋6.568 5，R2=0.932 7），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組肺組織NF-κB含量的比較

如表1所示：與對(duì)照組比較，模型組肺組織NF-κB含量顯著增加（P<0.01）。布洛芬5 mg/kg治療組肺組織NF-κB含量無明顯變化，而布洛芬10 mg/kg和20 mg/kg治療組肺組織NF-κB含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），而且布洛芬20 mg/kg和10 mg/kg治療組的NF-κB明顯低于布洛芬5 mg/kg治療組。說明布洛芬抑制肺纖維化引起的NO增高與下調(diào)NF-κB 有關(guān)。

表1 各組肺組織NF-κB的比較（%）Tab.1 Comparison of NF-κB expression in the lung tissues from different groups（%）

2.3 肺組織中iNOS蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果（圖1）顯示：與正常對(duì)照組比較，模型組肺組織iNOS表達(dá)明顯增加（P<0.01），布洛芬5mg/kg治療組無明顯變化，而布洛芬10mg/kg、20 mg/kg治療組則明顯降低（P<0.05，P<0.01），且布洛芬20 mg/kg、10 mg/kg治療組iNOS明顯低于布洛芬5 mg/kg治療組。

3 討論

NO作為一種生物信使分子和細(xì)胞毒性效應(yīng)分子，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，具有舒張動(dòng)脈、降低血小板黏滯性和抗炎作用，但過量NO及其代謝產(chǎn)物則可導(dǎo)致機(jī)體損傷。研究表明，肺內(nèi)NO的大量生成可能是促使肺纖維化形成的因素之一［4］，但其機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果表明：博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化NF-κB表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的NF-κB可能通過促進(jìn)iNOS的轉(zhuǎn)錄和翻譯增加其蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)NO的生成，而布洛芬則可明顯抑制上述反應(yīng)，起到抑制纖維化的作用。

博萊霉素引起的鼠肺纖維化是公認(rèn)的肺纖維化模型。目前認(rèn)為，NO在肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，特別是肺泡炎階段起重要作用［6，7］。其可能的機(jī)制為：（1）肺纖維化時(shí)產(chǎn)生的NO可擴(kuò)張微血管，增加毛細(xì)血管后微靜脈的滲出，加重炎癥和組織水腫；（2）通過影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物引起細(xì)胞毒作用［8］；（3）可能引起肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞的增殖和調(diào)亡，參與肺纖維化的形成［9，10］。布洛芬可抑制NO的大量產(chǎn)生，抑制肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)布洛芬可通過抑制NF-κB的表達(dá)從而下調(diào)iNOS的表達(dá)水平，從而降低NO水平。本研究結(jié)果為臨床治療肺纖維化提供了一種新的治療途徑。

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