孔令明，李芳，宗玉霞，韋奇才，楊海燕，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830021）

酶解條件對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響

孔令明1，李芳2，宗玉霞1，韋奇才1，楊海燕1，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830021）

摘 要：以核桃蛋白粉為原料制備核桃蛋白抗氧化活性肽，分別采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解，測(cè)定了不同酶作用下的核桃多肽抗氧化活性，確定堿性蛋白酶是酶解核桃蛋白的最適蛋白酶。研究了酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、底物濃度、酶添加量等酶解條件對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：不同的酶解條件對(duì)酶解產(chǎn)物核桃多肽的抗氧化活性有顯著影響，最佳酶解條件為：溫度50℃，時(shí)間120 min，pH8，底物濃度3%，酶添加量3%，在此酶解條件下制得的核桃多肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子的清除率分別為53.8%和50.0%，還原能力為51.7%。

關(guān)鍵詞：核桃；酶解；多肽；抗氧化活性

核桃（Juglans regiaL.）屬胡桃科核桃屬植物，又名胡桃、羌桃、萬歲子等，是世界四大干果之一。核桃蛋白屬優(yōu)質(zhì)蛋白，含有18種氨基酸，其中有8種是必需氨基酸，精氨酸、谷氨酸等含量相對(duì)較高[1-2]，是一種具有很高開發(fā)利用價(jià)值的植物蛋白?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，將蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解可獲得許多具有多種生物活性的肽，其具有的生物活性包括抗氧化作用、抗病毒、抗高血壓、激素調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等[3]。研究表明，酶解核桃蛋白獲得的核桃多肽具有較高的抗氧化活性[4]。

經(jīng)測(cè)定榨油后的核桃粕中含有33%的核桃蛋白，而長(zhǎng)期以來核桃粕多被用于肥料和飼料，造成了其中所含的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。若使用核桃粕為原料制備核桃蛋白抗氧化活性肽，則極大地增加了產(chǎn)品的附加值，故研究酶解核桃1蛋白制備核桃多肽的工藝具有重要意義。

本文就核桃蛋白酶解條件對(duì)其產(chǎn)物抗氧化活性的影響進(jìn)行了研究，為核桃蛋白資源的精深加工及綜合利用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

核桃蛋白粉：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制（從核桃粕中分離提取制得）；中性蛋白酶（80萬 U/g）、堿性蛋白酶（20萬 U/g）、木瓜蛋白酶（80萬U/g）：均為南寧龐博生物工程有限公司提供；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

HH-54恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；TD5AWS離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；85-2A恒溫磁力攪拌器：常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所；DEITA320手持式pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AR2140分析天平：上海奧豪斯公司；722N可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 羥自由基清除率的測(cè)定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[5]。1）取1 mL鄰二氮菲溶液（0.75 mmol/L）于試管中，依次加入2 mL磷酸鹽緩沖液 PBS（0.2 mol/L，pH7.4）和 1 mL 蒸餾水、1 mL 硫酸亞鐵液（0.75 mmol/L），充分混勻，加1 mL H2O2（體積分?jǐn)?shù)為0.01%），于37℃下恒溫水浴反應(yīng)60 min，于536 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度（AP）；2）同前步，用 1 mL 蒸餾水代替H2O2，測(cè)得的吸光度稱AB；3）用試樣液1 mL代替1）中的1 mL蒸餾水，測(cè)得到吸光度稱AS；羥基自由基清除率（d）計(jì)算公式如下：

1.2.2 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

采用鄰苯三酚方法[6]。在一系列的試管中加3 mL Tris-HCl緩沖液（pH8.2，0.05 mol/L），分別加入 100 μL待測(cè)樣品溶液，空白組加入同體積蒸餾水，再加入100 μL鄰苯三酚溶液（0.45 mol/L），振蕩并計(jì)時(shí)，至3 min時(shí)，立即加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的抗壞血酸溶液，振蕩，終止反應(yīng)，在325 nm下測(cè)吸光度A。以空白的吸光度為A空，加樣品溶液時(shí)的吸光度為A樣，超氧陰離子自由基清除率（p）計(jì)算公式如下：

1.2.3 還原能力的測(cè)定[7]

在1 mL樣品（空白用1 mL蒸餾水代替，其他試劑依次同下）中，加入2.5 mL鐵氰化鉀溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）和 2.5 mL磷酸鹽緩沖液PBS（0.2 mol/L，pH6.6），混勻后在50℃保溫20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%），混和后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%），混勻后在700 nm波長(zhǎng)下比色，記錄吸光度值（A0）。以VC作為對(duì)照（A），吸光度值越大則樣品的還原能力越強(qiáng)。還原能力（r）計(jì)算公式如下：

1.2.4 核桃蛋白酶解工藝流程

核桃蛋白粉→加水→調(diào)pH→加酶→水解→高溫滅酶→冷卻→離心→取上清液

1.2.5 酶制劑的篩選

選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分別在酶解溫度為50℃、酶解pH為8.0，底物濃度為2%，酶添加量為1.0%，酶解時(shí)間為120 min的條件下對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解，然后分別測(cè)定對(duì)應(yīng)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。

1.2.6 酶解條件的選擇

選定最適蛋白酶后，以酶解產(chǎn)物的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力為測(cè)定指標(biāo)，比較不同的酶解條件，即溫度、時(shí)間、pH、底物濃度及酶添加量對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

3種蛋白酶分別對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解，結(jié)果見圖1。

圖1 酶種類對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of different kinds of enzymes on anti-oxidative activity of walnut polypeptide

由圖1可以看出，這3種蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性差異較大，其中以堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力最強(qiáng)，分別為45.9%、43.5%、56.2%，故選用堿性蛋白酶作為酶解核桃蛋白的最適蛋白酶。

2.2 酶解溫度對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響

在酶解時(shí)間為120 min，酶解pH為8.0，底物濃度為2%，酶添加量為1.0%的條件下，酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃的條件下對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解，研究酶解溫度對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響，以確定最適的酶解溫度，結(jié)果如圖2。

圖2 酶解溫度對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of temperature on anti-oxidative activity of walnut polypeptide

從圖2可以看出，酶解溫度過高或過低都會(huì)影響核桃多肽的抗氧化活性。在溫度為50℃時(shí)，核桃多肽的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力最強(qiáng)。之后，由于隨溫度的升高，蛋白質(zhì)開始逐漸變性，核桃多肽的抗氧化活性則逐漸減弱，因此，酶解溫度以50℃為宜。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響

在酶解溫度為50℃，酶解pH為8.0，底物濃度為2%，酶添加量為1%的條件下，酶解時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180 min 的條件下對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解，研究酶解時(shí)間對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響，以確定最適的酶解時(shí)間，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of time on anti-oxidative activity of walnut polypeptide

由圖3可知，酶解時(shí)間在30 min～120 min的范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃多肽的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力均有不同程度的增強(qiáng)，在酶解時(shí)間為120 min時(shí)，核桃多肽抗氧化活性達(dá)到最強(qiáng)，之后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃多肽抗氧化活性開始減弱，故較適宜的酶解時(shí)間為120 min。

2.4 酶解pH對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響

在酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為120 min，底物濃度為2%，酶添加量為1%的條件下，酶解pH分別為7、7.5、8、8.5、9 的條件下對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解，研究酶解pH對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響，以確定最適的酶解pH，結(jié)果見圖4。

圖4 pH對(duì)核桃蛋白抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of pH on anti-oxidative activity of walnut polypeptide

從圖4可以看出，在酶解pH為8時(shí)，核桃多肽的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力達(dá)到最強(qiáng)，而對(duì)于堿性蛋白酶來說，當(dāng)溶液pH為8時(shí)其活性也最強(qiáng)，因此，酶解pH以8為宜。

2.5 底物濃度對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響

在酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為120 min，酶解pH為8，酶添加量為1%的條件下，底物濃度分別為2%、3%、4%、5%、6%的條件下對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解，研究底物濃度對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響，以確定最適的底物濃度，結(jié)果見圖5。

圖5 底物濃度對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on anti-oxidative activity of walnut polypeptide

由圖5可知，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，核桃多肽的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力最強(qiáng)。之后，隨著底物濃度的增加，核桃多肽的抗氧化活性逐漸減弱。這可能是由于較高的底物濃度，對(duì)酶的擴(kuò)散程度、酶解能力及底物的溶解能力均產(chǎn)生較大影響。綜合考慮，底物濃度選擇為3%較合適。

2.6 酶添加量對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響

在酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為120 min，酶解pH為8，底物濃度2%的條件下，酶添加量分別為2%、3%、4%、5%、6%的條件下對(duì)核桃蛋白進(jìn)行酶解，研究酶添加量對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響，以確定最適的酶添加量，結(jié)果見圖6。

圖6 酶添加量對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of enzyme amount on anti-oxidative activity of walnut polypeptide

圖6表明，酶添加量從2%到增加到3%時(shí)，核桃多肽的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力均顯著增強(qiáng)。在酶添加量為3%時(shí)，核桃多肽抗氧化活性達(dá)到最大值。之后，隨著酶添加量的逐漸加大，核桃多肽的抗氧化活性隨之減弱。因此，酶添加量以3%為宜。

2.7 最適條件下核桃多肽的抗氧化活性

采用堿性蛋白酶在溫度為50℃，pH為8，底物濃度為3%，酶添加量為3%的酶解條件下酶解核桃蛋白120 min，經(jīng)測(cè)定酶解產(chǎn)物的抗氧化活性較高，羥基自由基的清除率為53.8%，超氧陰離子的清除率為50.0%，還原能力為51.7%。

3 結(jié)論

以核桃多肽的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力為指標(biāo)，對(duì)中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)蛋白酶的種類對(duì)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性影響較大，確定了堿性蛋白酶可以作為核桃蛋白酶解的最適蛋白酶。研究了酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、底物濃度、酶添加量等酶解條件對(duì)核桃多肽抗氧化活性的影響，最終得到在溫度50℃，時(shí)間120 min，pH 8，底物濃度3%，酶添加量3%的酶解條件下，酶解產(chǎn)物核桃多肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子的清除率分別為53.8%和50.0%，還原能力為51.7%，可見此條件下制得的核桃多肽具有較高的抗氧化活性。

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Effect of Enzymatic Hydrolysis Conditions on Anti-oxidative Activity of Walnut Polypeptide

KONG Ling-ming1，LI Fang2，ZONG Yu-xia1，WEI Qi-cai1，YANG Hai-yan1，*
（1.College of Food and pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China）

Abstract：Walnut protein powder was used as raw material to prepare walnut polypeptide.Neutral protease，alcalase，papain were used respectively to hydrolyze walnut protein，through determining anti-oxidative activity of walnut polypeptide on different enzymes，the results that alcalase was optimal protease.Effect of temperature， time， pH， substrate concentration， adding amount of enzyme on anti-oxidative activity of enzymolysis product were studied.The results showed that，different hydrolysis conditions on anti-oxidative activity of enzymolysis product have significant effect.The most suitable condition was：temperature 50℃，time 120 min，pH 8，substrate concentration 3%，and adding amount of enzyme 3%.Under these conditions， the scavenging rate of hydroxyl radical and superoxide anion radical of walnut polypeptide was 53.8%and 50.0%respectively，reducibility power was 51.7%.

Key words：Walnut；enzymatic hydrolysis；polypeptide；anti-oxidative activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.030

新疆維吾爾自治區(qū)重大專項(xiàng)子課題（201130102-4-3）

孔令明（1976—），男（漢），副教授，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及綜合利用研究。

楊海燕，女，教授，博士。

2012-10-22