楊 波，陳海琴，張白曦，宋元達(dá)，陳永泉，陳 衛(wèi)，張 灝

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

共軛亞油酸(CLA，18∶2)是一類(lèi)具有共軛雙鍵的亞油酸(LA，18∶2)的幾何和位置異構(gòu)體的總稱(chēng)。它具有很多營(yíng)養(yǎng)和保健功能，如抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化和延緩機(jī)體免疫力衰退、減肥等［1－3］。瘤胃菌和丙酸菌中催化LA轉(zhuǎn)化為活性CLA的酶為亞油酸異構(gòu)酶［4－6］，與瘤胃菌中較為清晰的催化機(jī)制相比，乳酸菌產(chǎn)CLA的機(jī)理至今尚無(wú)廣泛報(bào)道。最新的研究表明，植物乳桿菌AKU1009a中LA被MCRA催化為10－HOE后被另外兩個(gè)酶進(jìn)一步催化而轉(zhuǎn)變?yōu)镃LA［7］。該催化涉及多個(gè)酶，其中第一步反應(yīng)是亞油酸被轉(zhuǎn)化為10－羥基－順12－十八碳烯酸，后經(jīng)雙鍵異構(gòu)和脫水兩步反應(yīng)而轉(zhuǎn)變?yōu)镃LA。第一步酶，即水合酶，與先前被預(yù)測(cè)具有多不飽和脂肪酸水合酶功能的肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原(Myosin cross reactive antigen，MCRA)具有良好的同源性，因此對(duì)該類(lèi)抗原的酶學(xué)功能的研究顯得非常重要。肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原最早發(fā)現(xiàn)于化膿鏈球菌，并被預(yù)測(cè)具有轉(zhuǎn)化產(chǎn)生CLA的能力［8］，這類(lèi)抗原在乳酸菌中普遍存在。Rosson等［9］嘗試過(guò)驗(yàn)證羅伊氏乳桿菌 PYR8中的MCRA亞油酸異構(gòu)酶的活性，但結(jié)果顯示該蛋白并不能實(shí)現(xiàn)LA至CLA的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物中檢測(cè)到了痕量的羥基化衍生物，本實(shí)驗(yàn)室從泡菜中篩選到一株產(chǎn)CLA能力的乳酸菌－植物乳桿菌ZS2058，經(jīng)研究得知該菌株在MRS培養(yǎng)基中經(jīng)0.5mg/mL的亞油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)后，所獲得的菌體細(xì)胞具有較強(qiáng)的CLA生成能力［10］。本研究依據(jù)已報(bào)道的瘤胃菌中亞油酸異構(gòu)酶及乳酸菌中亞油酸水合酶－肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原MCRA的基因序列特征，通過(guò)生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)引物從植物乳桿菌ZS2058的基因組中克隆獲得該基因序列，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體 pET28a－MCRA，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化后對(duì)MCRA基因的活性進(jìn)行研究。這是首次在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)植物乳桿菌ZS2058中肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原的活性表達(dá)，這將為實(shí)現(xiàn)完整闡述植物乳桿菌產(chǎn)CLA的機(jī)理提供理論依據(jù)。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ZS2058(Lactobacillus plantarum ZS2058)、大腸桿菌 Escherichia coli TOP10、E.coli BL21 由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pET28a Novagen公司;LB(Luria－Bertani)培養(yǎng)基 1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，使用時(shí)添加卡那霉素至終濃度50μg/mL;MRS培養(yǎng)基 2%葡萄糖，1%蛋白胨，1%牛肉膏，0.5%酵母膏，0.2%檸檬酸氫二銨，0.5%乙酸鈉，0.2%磷酸氫二鉀，0.058%硫酸鎂，0.025%硫酸錳，0.1%吐溫 80，pH6.2～6.6，用于培養(yǎng)目的基因來(lái)源菌－植物乳桿菌ZS2058;限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶 Takara公司;高保真DNA聚合酶KOD plusToyobo公司;基因組提取試劑盒 (北京)天根生物科技公司;底物 LA、內(nèi)標(biāo)十九烷酸Sigma－Aldrich公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Fermentas;其他試劑 進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)中的引物的合成和測(cè)序工作由上海博尚生物有限公司完成。

PCR儀 Bio－RadT100、電泳儀 Bio－Rad PowerPac Basic型 美國(guó) Bio－Rad公司;鎳柱Chelating sepharoseTMFast Flow 美國(guó)GE公司;氣質(zhì)聯(lián)用色譜工作站Finnigan Trance GC/Finnigan Trance MS 美國(guó)Thermo公司。

本實(shí)驗(yàn)所用的引物見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MCRA基因的擴(kuò)增 依據(jù)NCBI已報(bào)道的乳酸菌中亞油酸水合酶－肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原MCRA的基因序列特征，通過(guò)生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)表 1 引物(GenBank:JF747255.1，ZS2058MCRA－F、ZS2058MCRA－R)，分別引入 Xhol I、Not I酶切位點(diǎn)(下劃線(xiàn))，以植物乳桿菌ZS2058的基因組為模板用高保真KOD plus進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件:95℃ 5min;95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 2min，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10min。

1.2.2 重組質(zhì)粒及重組菌的構(gòu)建 將MCRA片段的PCR產(chǎn)物通過(guò)Xhol I和Not I雙酶切克隆至大腸桿菌質(zhì)粒pET28a，得到表達(dá)載體pET28a－MCRA，將其化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌pET28a－MCRA/E.coli BL21(DE3)，同時(shí)構(gòu)建 pET28a/E.coli BL21(DE3)作為陰性對(duì)照，并將重組菌中的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)的SDS－PAGE和Western Blot檢驗(yàn) 挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃震蕩培養(yǎng)至 OD600為0.6，加入 IPTG至終濃度0.8mmol/L，20℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20h。離心收集菌體并重懸于PBS緩沖液中(0.1mol/L，pH8.0)，在冰浴中進(jìn)行超聲破碎，離心得上清和沉淀，進(jìn)而將全細(xì)胞、上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE和Western Blot分析，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［11］，分離膠濃度為12%。

1.2.4 重組酶表達(dá)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度調(diào)整為0.01mmol/L和0.1mmol/L，誘導(dǎo)溫度分別為16℃和20℃，誘導(dǎo)20h。將誘導(dǎo)劑改換為0.2%乳糖，誘導(dǎo)條件仍為20℃，20h。

1.2.5 鎳柱初步純化重組酶 離心收集誘導(dǎo)結(jié)束的菌體，重懸于20mL磷酸鹽緩沖液中，加入20mg溶菌酶，4℃孵育10min，超聲波破碎。后細(xì)胞破碎液離心，上清用鎳柱純化，按照GE公司的產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作。用咪唑濃度為50mmol/L和100mmol/L的緩沖液沖洗樣品柱，洗去雜蛋白。然后用咪唑濃度為200和300mmol/L的緩沖液洗脫目的蛋白，收集樣品進(jìn)行SDS－PAGE分析和Western Blot分析。

1.2.6 重組蛋白活性的GC－MS檢測(cè) 在Volkov等［12］和 Rosberg－Cody 等［13］檢驗(yàn)該類(lèi)蛋白活性的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，具體反應(yīng)如下:將50μg LA或油酸(OA)和10μg純化的酶，于1mL Buffer A(0.1mol/L Tris/HCl，pH6.5，0.1mol/L NaCl)中 25℃反應(yīng) 1h。根據(jù)Bligh和Dyer的方法［14］提取脂肪酸，以十九烷酸做內(nèi)標(biāo)，提取的脂肪酸溶于甲醇后以重氮甲烷進(jìn)行甲酯化，甲酯化脂肪酸最終用1mL正己烷回溶，用于GC－MS檢測(cè)分析。GC－MS條件:Finnigan Trance GC/Finnigan Trance MS(美國(guó) Thermo)，色譜柱:Agilent DB－WAX(30m ×0.250mm id×0.25μm，美國(guó)安捷倫)。GC升溫程序:180℃保持 0.5min，后以5℃/min的升溫速率升至230℃，保持13min。載體流量He:8mL/min，載氣流量He:8mL/min，氣化室溫度:250℃，進(jìn)樣量:10μL，分流比:62∶1。質(zhì)譜檢測(cè)條件:離子化方式:EI，電離電壓:70eV;發(fā)射電流200μA;柱上溫度250℃;離子室溫度230℃;檢測(cè)器電壓350V。

2 結(jié)果與分析

2.1 MCRA基因的擴(kuò)增

以L(fǎng).plantarum ZS2058基因組為模板，PCR擴(kuò)增MCRA基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到1700bp大小的片段(圖1)，與預(yù)期的理論值大小相同。

2.2 表達(dá)載體pET28a－MCRA的構(gòu)建

用Not I和Xhol I酶切質(zhì)粒PCR產(chǎn)物MCRA和pET28a，膠回收目的片段，16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞。過(guò)夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證和酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，得到預(yù)期大小的條帶。后經(jīng)測(cè)序顯示成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a－MCRA。

圖1 PCR擴(kuò)增MCRA基因Fig.1 PCR amplification of MCRA gene

圖2 鑒定重組質(zhì)粒pET28a－MCRAFig.2 Identification of recombined plasmid pET28a－MCRA

2.3 重組表達(dá)宿主菌的構(gòu)建與表達(dá)

將上述的重組質(zhì)粒pET28a－MCRA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)，構(gòu)建重組菌 pET28a－MCRA/E.coli BL21(DE3)。挑取能在含有Kana的LB平板上生長(zhǎng)的菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6時(shí)，添加IPTG至終濃度0.8mmol/L，20℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20h。將全細(xì)胞、上清和沉淀樣品進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)，同時(shí)以質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化的pET28a/E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作為空白對(duì)照。結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白基本都在沉淀部分，即包涵體。對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度等進(jìn)行調(diào)整后，目標(biāo)蛋白仍不可溶。后將誘導(dǎo)劑改為0.2%乳糖，20℃誘導(dǎo)20h后，按同樣方法處理，對(duì)所得全細(xì)胞、上清和沉淀樣品再次進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明，在上清部分約67ku處有一條明顯的目標(biāo)蛋白條帶(圖3)。SDS－PAGE分析細(xì)胞破碎的上清和沉淀，表明MCRA重組蛋白主要以胞內(nèi)可溶形式存在。

2.4 重組蛋白MCRA的純化和鑒定

對(duì)鎳柱純化前及純化后的樣品，以及空白對(duì)照分別進(jìn)行了SDS－PAGE分析，結(jié)果顯示目的條帶大小為約67ku(見(jiàn)圖4中A部分)，且純化后的蛋白條帶單一，Quantity one軟件分析表明純化后的蛋白純度大于95%。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)樣品，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)一步純化后，最終可獲得34.4mg/L純化的MCRA重組蛋白。引物設(shè)計(jì)時(shí)保留了pET28a載體N端His－Tag標(biāo)簽，即使得重組蛋白的N端帶有His－tag標(biāo)簽，利用這個(gè)特點(diǎn)對(duì)空白對(duì)照，純化前及純化后的樣品進(jìn)行了Western Blot分析，結(jié)果(見(jiàn)圖4中B部分)再次證實(shí)驗(yàn)證了目標(biāo)蛋白成功表達(dá)。

圖3 0.2%乳糖誘導(dǎo)的重組菌株蛋白的SDS－PAGE檢驗(yàn)Fig.3 SDS－PAGE analysis of the proteins from recombinants with 0.2%lactose induction

圖4 重組菌株蛋白的SDS－PAGE和Western Blot分析Fig.4 SDS－PAGE analysis and Western Blotof the proteins from recombinants

2.5 重組蛋白MCRA酶活性的GC－MS檢測(cè)

在先前報(bào)道［12－13］的基礎(chǔ)上，利用亞油酸和油酸兩種底物對(duì)純化后的蛋白的活性進(jìn)行了檢驗(yàn)，結(jié)果顯示MCRA蛋白可對(duì)亞油酸和油酸分別進(jìn)行羥基化。

以亞油酸為底物時(shí)，GC－MS的結(jié)果顯示在22.39min處有一產(chǎn)物峰(圖5A)，結(jié)合 MS結(jié)果及10－羥基－順－12－十八碳烯酸(10－HOE)的理論碎片(圖5B)等信息，可知產(chǎn)物就是10－羥基－順12－十八碳烯酸。以油酸為底物時(shí)在21.76min處有一個(gè)產(chǎn)物峰(圖6A)，MS結(jié)果及10－羥基－十八碳酸(10－HO)的理論碎片(圖6B)等信息，可知產(chǎn)物就是10－羥基－十八碳酸。

圖5 以亞油酸為底物GC－MS檢測(cè)結(jié)果Fig.5 GC－MS result:linoleic acid as a substrate

圖6 以油酸為底物GC－MS檢測(cè)結(jié)果Fig.6 GC－MS result:oleic acid as a substrate

GC－MS檢測(cè)結(jié)果顯示該蛋白不能催化亞油酸直接轉(zhuǎn)變?yōu)镃LA，表明該蛋白并非亞油酸異構(gòu)酶，這與 Rosson 等［9］，Volkov 等［12］和 Rosberg－Cody 等［13］報(bào)道是一致的，即以亞油酸、油酸為產(chǎn)物得到相應(yīng)的羥基化衍生物，即肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原這類(lèi)蛋白為催化CLA合成過(guò)程中的脂肪酸水合酶。本課題組先前的研究結(jié)果顯示，植物乳桿菌ZS2058在轉(zhuǎn)化LA產(chǎn)CLA的同時(shí)，積累大量的10－HOE，而MCRA蛋白催化了亞油酸至10－HOE的轉(zhuǎn)變，這也與Kishino等［7］人的研究結(jié)果相符合，因此植物乳桿菌ZS2058中MCRA即為催化產(chǎn)CLA第一步反應(yīng)中的水合酶。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功的將L.plantarum ZS2058中的肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原基因MCRA在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了可溶表達(dá)，活性檢驗(yàn)結(jié)果顯示該蛋白可對(duì)亞油酸、油酸進(jìn)行水合，將其轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的羥基化衍生物。本研究證實(shí)了植物乳桿菌ZS2058的MCRA蛋白僅起到水合酶的作用。根據(jù)先前文獻(xiàn)報(bào)道及本課題組的相關(guān)研究結(jié)果可知，該羥基化衍生物在乳酸菌中可進(jìn)一步被催化轉(zhuǎn)變?yōu)镃LA。本研究同時(shí)也為進(jìn)一步擴(kuò)大研究乳酸菌產(chǎn)CLA的機(jī)理研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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