劉寶祥，樸永哲，翟明昌，董 亮，郭敏利，周華成，趙長(zhǎng)新，*

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600;3.華潤(rùn)雪花啤酒(中國(guó))有限公司，河北三河065201)

大麥?zhǔn)且环N重要的糧食作物和釀造啤酒的主要原料。蛋白質(zhì)是大麥的一種主要成分之一，主要分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等亞組分，大麥中蛋白質(zhì)對(duì)啤酒的泡沫、風(fēng)味、穩(wěn)定性等指標(biāo)有很大的影響。其中，清蛋白和球蛋白是麥汁中蛋白質(zhì)的主要來源，與麥芽質(zhì)量和啤酒的泡持性、非生物穩(wěn)定性有著重要關(guān)系［1］。大麥發(fā)芽之前，水分含量小于13%，一切生理活動(dòng)幾乎停止，大麥蛋白質(zhì)處于穩(wěn)定狀態(tài)。大麥經(jīng)浸漬后含水量迅速達(dá)到30%～35%，胚芽產(chǎn)生赤霉素激活糊粉層中的水解酶，使種子獲得新陳代謝能力［2－3］。在蛋白酶酶系的作用下，胚乳細(xì)胞壁被分解，胚乳儲(chǔ)存的物質(zhì)開始降解并為胚軸生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)［4－5］。隨著發(fā)芽的進(jìn)行，α－淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、β－葡聚糖酶的活力顯著提高，大麥的酶量和種類大量增加，形成了麥粒中的亞組分含量變化［6］。大麥總蛋白質(zhì)含量基本上保持不變，但清蛋白含量增加，球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量下降;部分高分子儲(chǔ)藏類蛋白分解為肽和氨基酸，作為營(yíng)養(yǎng)分泌到胚，部分用于合成新的根芽和葉芽細(xì)胞［7］。即發(fā)芽過程是大麥蛋白質(zhì)不斷分解與合成的過程［1，8］。這些物質(zhì)變化使麥粒中的高分子物質(zhì)得到一定降解，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更容易溶解，有利于后期的糖化過程［9］。目前大多數(shù)研究側(cè)重于大麥蛋白質(zhì)的鑒定和功能分析，或制麥過程中熱穩(wěn)定蛋白和酶活力的變化，而對(duì)大麥發(fā)芽過程中的蛋白質(zhì)組的變化研究報(bào)道較少［7，10－12］。發(fā)芽過程是麥粒中各類酶系及其存貯蛋白質(zhì)和淀粉發(fā)生作用的統(tǒng)一體，發(fā)芽進(jìn)程的正常與否取決于大麥中酶系及其蛋白質(zhì)能否適度的溶解。雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)的有力工具，是目前可以在一塊凝膠上顯示上千種蛋白質(zhì)的方法，對(duì)于研究大麥蛋白質(zhì)組具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)利用雙向電泳監(jiān)測(cè)大麥發(fā)芽過程中水溶蛋白質(zhì)組的變化，進(jìn)一步明確大麥發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律，為麥芽制造和大麥發(fā)芽生理的研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥品種:Schooner，澳大利亞產(chǎn)，經(jīng)精選機(jī)精選的Ι級(jí)大麥，水分:10.9%，千粒重:43.0g，發(fā)芽率99%，蛋白質(zhì)含量10.8% 中糧麥芽(大連)有限公司惠贈(zèng);蛋白質(zhì)提取過程所用試劑為優(yōu)級(jí)純，其余步驟為分析純，所用水均為雙蒸水。

多功能電泳儀 北京六一廠;Binta 2020D凝膠成像系統(tǒng) BINTA;PDQuest8.0分析軟件 Biorad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥芽制備及蛋白質(zhì)提取 取100g大麥浸麥30h(濕浸6h→干浸16h→濕浸5h→干浸3h)，浸麥度達(dá)到45%。發(fā)芽過程模擬箱式發(fā)芽，麥層溫度16～18℃，相對(duì)濕度 90%，發(fā)芽開始記為 0h，發(fā)芽共96h，定時(shí)取樣10g，真空干燥后，液氮研磨提取蛋白質(zhì)。

水溶蛋白質(zhì)組的提取和裂解采用緩沖液苯酚法，Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后分裝［13］，置于－80℃冰箱備用［14］。

1.2.2 雙向電泳

1.2.2.1 膠條制作 在翟明昌的方法［15］基礎(chǔ)上略加改進(jìn):取0.6g尿素，540μL雙蒸水，200μL 30%丙烯酰胺溶液，pH4～6 載體兩性電解質(zhì)24μL，pH3～10 載體兩性電解質(zhì)溶液4.8μL，輕緩混勻后依次加入5μL 10%過硫酸銨和4μL TEMED?；靹蚝罂焖傥?00μL上述混合液，從玻璃管(直徑1mm，長(zhǎng)10cm)的一端緩慢均勻灌入，注膠量保證每根膠長(zhǎng)度為7cm，室溫聚合1h。

1.2.2.2 等電聚焦及電泳 陰極電泳緩沖液:20mmol/L NaOH 150mL，陽極電泳緩沖液:10mmol/L磷酸200mL。

電泳條件:接通電源，室溫下200V恒壓電泳30min，500V恒壓電泳30min，1350V恒壓電泳4h。

等點(diǎn)聚焦結(jié)束后將膠條從玻璃管中均勻擠出，在 0.05mol/L Tris－HCl(pH8.8)、30%(W/V)甘油、2.3%(W/V)SDS、6mmol/L尿素的平衡緩沖液中平衡30min，轉(zhuǎn)移至12%分離凝膠，20mA恒流電泳。所得到的凝膠進(jìn)行“Blue Silver”考馬斯亮藍(lán)染色，雙蒸水脫色［16］。

1.2.4 凝膠圖像分析 通過Binta 2020D型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，PDQuest 8.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥發(fā)芽過程中水溶蛋白質(zhì)含量變化

大麥發(fā)芽過程中就其總氮而言是不變化的，但其蛋白亞組分(清蛋白，球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白)含量在發(fā)芽前后發(fā)生顯著變化，麥粒充分吸水后胚內(nèi)產(chǎn)生的赤霉素誘導(dǎo)糊粉層中的淀粉酶、蛋白酶等各種水解酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶等合成酶的激活和生成［7，10］。反映在水溶蛋白質(zhì)含量上仍然是增加的，這也有利于糖化過程的蛋白質(zhì)溶出［2－3］。

圖1可見，隨著發(fā)芽進(jìn)行，水溶性蛋白質(zhì)含量逐漸上升，發(fā)芽48h達(dá)到最高峰，發(fā)芽結(jié)束時(shí)略有下降。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)經(jīng)過發(fā)芽，水溶蛋白質(zhì)含量是增加的，但發(fā)芽過程中大麥水溶蛋白質(zhì)含量不是一直升高的過程:前期主要是大麥吸水、酶系重新合成和蛋白質(zhì)降解的過程，水溶蛋白質(zhì)含量下降，可見，這一階段主要以蛋白質(zhì)的降解為主［5］;隨著發(fā)芽的進(jìn)行，酶系的不斷作用，部分醇溶蛋白殘基形成交聯(lián)變?yōu)樗?，同時(shí)還會(huì)新合成一些水溶蛋白，使得蛋白質(zhì)含量顯著上升，發(fā)芽48h水溶性蛋白達(dá)到最高峰［17］;最后，由于酶活力的增加，蛋白質(zhì)繼續(xù)降解，一些水溶性蛋白質(zhì)輸送至根芽，麥粒中水溶性蛋白質(zhì)含量略有下降［6］?？傮w來看，發(fā)芽后綠麥芽水溶蛋白質(zhì)含量高于未發(fā)芽大麥。

圖1 大麥發(fā)芽過程中水溶蛋白質(zhì)含量的變化Fig.1 Changes of barley content during the malting process

2.2 雙向電泳解析

有研究表明大麥的水溶性蛋白質(zhì)大部分為酶蛋白，所以水溶性蛋白質(zhì)組的變化在一定程度上可以反映酶本身變化和其催化的結(jié)果［18］。大麥發(fā)芽過程中水溶蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜如圖2(A～E)所示，運(yùn)用Pdquest 8.0 軟件分析，分別有 804、549、547、572、450、476個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。大麥在發(fā)芽過程中有379種蛋白質(zhì)的濃度降低或消失，同時(shí)77種蛋白質(zhì)隨著發(fā)芽進(jìn)行，新增或濃度升高。這些蛋白質(zhì)很大一部分具有一定功能的糖類和蛋白質(zhì)的降解酶、各種代謝酶，以及抗菌和自身排異的蛋白質(zhì)類［10］。

圖2(A)白框區(qū)域1、2分別放大為圖3～圖4，結(jié)合圖2分析，在大麥發(fā)芽的浸麥階段圖2(A～B)，小分子蛋白質(zhì)的降解消失尤其明顯;浸麥階段大麥迅速吸水后，胚產(chǎn)生激素激活糊粉層重新合成水解酶系［5］，水溶小分子蛋白質(zhì)最先受到酶的水解作用或參與合成體系，為胚乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解提供內(nèi)在條件。發(fā)芽0～24h圖2(B～C)，降解和新合成的蛋白質(zhì)數(shù)量基本相等，但蛋白質(zhì)總數(shù)量上在這一階段基本無變化。24～48h圖2(C～D)，新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)明顯增加，高于蛋白質(zhì)的降解，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)組總數(shù)量的增加和2.1中發(fā)芽48h，水溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高峰。48～72h圖2(D～E)主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的降解和豐度減小，表明此時(shí)酶活力已經(jīng)達(dá)到最大，幾乎沒有新蛋白質(zhì)產(chǎn)生。72～96h圖2(E～F)，蛋白質(zhì)種類變化很小，蛋白質(zhì)仍然有降解但種類上已經(jīng)趨于穩(wěn)定。

圖2 大麥發(fā)芽過程中水溶蛋白質(zhì)雙向圖譜Fig.2 Changes of barley proteome during the malting process

圖3 區(qū)域1蛋白質(zhì)發(fā)芽過程中的變化Fig.3 Changes of barley proteome(area 1)during the malting process

圖4 區(qū)域2蛋白質(zhì)發(fā)芽過程中的變化Fig.4 Changes of barley proteome(area 2)during the malting process

3 結(jié)論

3.1 通過研究大麥發(fā)芽過程中的水溶蛋白質(zhì)組變化，表明大麥發(fā)芽不僅僅是蛋白質(zhì)的降解過程:從種類上看，大麥中的802種水溶蛋白質(zhì)，只有少于424種蛋白質(zhì)能保留下來，超過379種蛋白質(zhì)降解消失或豐度降低，有77種新蛋白質(zhì)產(chǎn)生;水溶蛋白質(zhì)含量上看，最終蛋白質(zhì)含量高于大麥，說明發(fā)芽可以促進(jìn)大麥的溶解，增加大麥蛋白質(zhì)的水溶性，有利于大麥在糖化過程的溶解。綜合上述蛋白質(zhì)組變化表明:浸麥階段主要是蛋白質(zhì)的降解過程;發(fā)芽初始階段蛋白質(zhì)的降解和合成轉(zhuǎn)化是一個(gè)逐漸趨于平衡的過程;到達(dá)發(fā)芽后期蛋白質(zhì)的變化基本趨于平衡。

3.2 本文運(yùn)用雙向電泳檢測(cè)大麥發(fā)芽過程中水溶蛋白質(zhì)的變化，從水溶蛋白質(zhì)組的層面探究了大麥發(fā)芽的生理變化過程。通過每24h取樣，對(duì)大麥發(fā)芽過程蛋白質(zhì)組的變化有一個(gè)比較直觀、全面的認(rèn)識(shí)，為下一步蛋白質(zhì)鑒定奠定基礎(chǔ)。

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