謝普軍，黃立新，*，張彩虹，游 鳳，王成章，周 昊

（1.中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局林產(chǎn)化學工程重點開放性實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇南京210042；2.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091）

橄欖苦苷是一種屬于裂環(huán)烯醚萜苷類特殊單萜化合物，普遍存在于木犀屬、女貞屬、丁香屬等油橄欖樹的植物組織中[1]。作為油橄欖樹代表物質(zhì)，學者對它的研究頗多。經(jīng)一些學者研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖樹的組織中橄欖苦苷含量因不同品種、地區(qū)和時間而不同[2]，與油橄欖樹的其他組織相比，油橄欖樹葉的含量最高[3]。從1908年至今，從橄欖油里發(fā)現(xiàn)具有苦澀味的物質(zhì)橄欖苦苷[4]，經(jīng)過100多年的研究發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷具有多種藥理生物活性，如抗炎、抗各種微生物、抗氧化、抗腫瘤、抗癌和降血糖[5-10]等。橄欖苦苷的諸多活性使其在食品、藥品和化妝品方面應用十分廣泛[11]，現(xiàn)已有橄欖苦苷的相關(guān)產(chǎn)品問世。另外研究學者報道了很多有關(guān)橄欖苦苷提取分離富集和加工成產(chǎn)品等方面內(nèi)容[12-13]，而這些往往疏忽了加工過程中橄欖苦苷變化的研究。并且筆者通過查閱國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，大量文獻主要集中在橄欖苦苷的提取分離及一些生物活性方面的研究，僅Malik等[14]報道了將新鮮采摘后的油橄欖葉立即放置于-80℃貯存，然后對其進行解凍實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在室溫條件下解凍30min后，因β-葡萄糖苷酶作用使其降解了95%；而其他因素如光、pH等對橄欖苦苷作用并未詳細闡述，并且關(guān)于油橄欖葉加工過程中橄欖苦苷可能發(fā)生的變化也未見其他報道。基于此，本文首次通過控制不同光源、pH、溫度和時間，研究了不同因素對油橄欖葉提取物中橄欖苦苷的變化情況。由于Fe2+是許多氧化反應催化劑的活性中心，抑制Fe2+與催化劑的基體結(jié)合也就意味著起到了一定的抗氧化作用，因此同時也考察了油橄欖葉提取物對Fe2+的螯合作用，為油橄欖葉的有效利用提供數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

油橄欖葉 佛奧品種；橄欖苦苷標準品 天津一方科技有限公司（批號：10082613）；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，分析純），抗壞血酸（VC，分析純）西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；菲洛嗪 分析純；乙二胺四乙酸（EDTA）分析純；甲醇 色譜純；乙醇 分析純；正己烷 分析純；異丙醇 色譜純；去離子水 自制。

AR2140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；WK-400A高速藥物粉碎機 青州市精誠機械有限公司；HH-4數(shù)顯水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；超聲波清洗器 南京壘君達超聲電子設(shè)備有限公司；LC-20A高效液相色譜（包括LC-20ATvp，SPD-20A紫外檢測器，色譜工作站LC-Solution）日本島津株式會社；HT-130色譜柱恒溫箱 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；Hypersil ODS2色譜柱 大連依利特分析儀器有限公司（批號：11164）；TG-DSC 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油橄欖葉提取物的制備 采用自然陰干的油橄欖葉（佛奧品種），粉碎至40～60目，存儲于陰暗干燥處備用。精確稱取50g上述備用的油橄欖葉粉于提取容器中，75%乙醇-水溶液作為提取溶劑，進行超聲輔助提取[12]。得到的收集液再過AB-8大孔樹脂進行純化[15]，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇并最后通過真空冷凍干燥制得的油橄欖葉提取物，所獲得的提取物再經(jīng)HPLC分析測定其中橄欖苦苷的含量（Oleuropein，27.3%）。

1.2.2 橄欖苦苷溶液的制備 精確稱取1g油橄欖葉提取物于500mL的容量瓶中，用30%乙醇溶解并得到濃度為2mg/mL溶液，作為本實驗中的母液。

1.2.3 光對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響 從母液中移取50mL至具塞透明玻璃瓶中，分別使用不同光源：日光燈（2000Lux）、254nm的紫外燈等對其進行照射，并與在黑暗環(huán)境中做對比，照射時間為1h，每隔10min檢測其中的橄欖苦苷含量。

1.2.4 溫度對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響 從母液中移取50mL至具塞透明玻璃瓶中，在不同水浴溫度50～100℃靜置3h，檢測其中橄欖苦苷含量的變化。

為了繼續(xù)研究溫度對橄欖苦苷的影響，使用橄欖苦苷標準品，并對其做TG-DSC分析，考察高溫條件下，是否對橄欖苦苷造成分解。

1.2.5 時間對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響 從母液中吸取50mL溶液至具塞玻璃瓶中，分別在4、25℃的黑暗條件下放置27d，定期對其進行檢測以觀察橄欖苦苷含量的變化。

1.2.6 不同pH對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響 首先用0.1mol/L的HCl和0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，配制成不同pH1～14，分別取1mL不同pH的水溶液與4mL的母液混合均勻，常溫下靜置5min，檢測其中橄欖苦苷含量的變化。

1.2.7 對金屬離子的螯合作用[16]將油橄欖葉提取物的母液稀釋成不同濃度的溶液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL。分別取1.0mL不同提取物溶液與FeCl2（0.5mL，1.0mmol/L）混合均勻，再加入的菲洛嗪（1mL，5.0mmol/L），最后加入5mL水稀釋靜置10min，在562nm下檢測混合液的吸光度。本實驗以EDTA作為參考物進行對照。

1.2.8 油橄欖葉中橄欖苦苷含量的計算公式[17]：

2 結(jié)果與討論

2.1 光對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響

光對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響見圖1，橄欖苦苷含量幾乎沒有變化。此結(jié)果說明橄欖苦苷對實驗條件下的常用光比較穩(wěn)定?？赡苁情蠙炜嘬瘴展獾哪芰亢?，不至于使其發(fā)生分解。但如果光的強度一直增大，橄欖苦苷含有的易斷裂的酯鍵和醚鍵吸收特定波長的光且在強度夠的前提下，可能斷裂。但因?qū)嶒灄l件有限，沒有繼續(xù)深入研究。

圖1 光對橄欖苦苷的影響Fig.1 Effect of light on oleuropein

2.2 溫度對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響

溫度是所有加工過程需要考察的一個重要因素，因此溫度對橄欖苦苷的影響的考察十分有必要。在50～100℃條件下，靜置3h，橄欖苦苷并沒有發(fā)生明顯變化，如圖2所示。也即在常用加工的溫度條件下不會發(fā)生降解作用。為了繼續(xù)深入研究溫度對橄欖苦苷的穩(wěn)定性的影響，使用橄欖苦苷標準品進行TG-DSC分析實驗，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，從TG的結(jié)果分析，橄欖苦苷在小于232.3℃沒有發(fā)生變化，而在約232.3℃開始發(fā)生分解，在232.3～550℃，橄欖苦苷降解作用基本完成。在550～1000℃，橄欖苦苷分解后的質(zhì)量保持恒定。另一方面，從DSC曲線分析可知，橄欖苦苷的分解是一個放熱過程。因此，要保持橄欖苦苷不降解，加工油橄欖葉的溫度不應該超過232.3℃。

圖2 溫度對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on oleuropein

圖3 橄欖苦苷標準品的TG-DSCFig.3 TG-DSC of Oleuropein standard

2.3 時間對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響

加工過程的另一個重要因素是時間。當隨著時間的延長，油橄欖葉中的橄欖苦苷可能會發(fā)生降解或聚合。因此，對時間的因素考察也是研究橄欖苦苷穩(wěn)定性很重要的一個方面。

如圖4所示，橄欖苦苷在第2d開始發(fā)生降解，且隨著放置時間的延長，降解率逐漸增大，在第27d，在溫度為4℃下，橄欖苦苷降解率為38.1%，而常溫25℃下，橄欖苦苷幾乎全部降解，降解率達95.24%。之所以會發(fā)生降解，是因為油橄欖葉中含有β-葡萄糖苷酶，會促進橄欖苦苷分解[14]，25℃為該酶的最適溫度。

圖4 時間對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of time on oleuropein stability

為提高油橄欖葉中橄欖苦苷穩(wěn)定性，筆者對油橄欖葉提取物的溶液做100℃高溫5min進行滅酶處理，實驗結(jié)果顯示，在30d之內(nèi)，其中的橄欖苦苷含量幾乎沒有變化。此結(jié)果也進一步說明了橄欖苦苷隨時間逐步降解的原因是由β-葡萄糖苷酶所導致的。

2.4 不同pH對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，與酸性條件下相比，橄欖苦苷在堿性條件下更容易水解，在酸性條件下，橄欖苦苷幾乎沒有影響，而在堿性條件下，在pH大于10時，橄欖苦苷發(fā)生降解，而在pH為14時，橄欖苦苷已經(jīng)全部降解，因此，橄欖苦苷耐酸不耐堿，其結(jié)果與王成章等[18]的研究結(jié)果一致，作用過程如圖6（b）所示，橄欖苦苷在酸或堿作用下生成羥基酪醇和欖香酸。

圖5 pH對橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on oleuropein

圖6 橄欖苦苷在酸堿及酶的條件下分解作用Fig.6 Oleuropein decomposition process on acid，alkali and enzyme conditions stability

2.5 對金屬離子的螯合作用

圖7 螯合亞鐵離子的作用Fig.7 Chelation action of ferrous ions

由圖7可知，在螯合亞鐵實驗中，EDTA螯合作用最強且效果較明顯，在其濃度為0.8mg/mL時，螯合率為96.7%；而油橄欖葉提取物螯合作用較低，油橄欖葉提取物（OLE）隨著濃度的升高，OLE的螯合作用增強。在其濃度為1.2mg/mL時，螯合率能達約20%。因此，提取物在一定條件下，可以充當螯合劑，作為輔助抗氧化作用，因為生物體內(nèi)很多氧化反應的酶中需要亞鐵離子的催化作用，OLE螯合亞鐵離子也就抑制了相關(guān)氧化反應的過程，也就防止了氧化損傷，起到了抗氧化作用。

3 結(jié)論

3.1 橄欖苦苷對常用光比較穩(wěn)定；在3h、100℃的條件下，橄欖苦苷含量沒有發(fā)生降解；橄欖苦苷的降解溫度為232.3℃，并且該過程是一個放熱過程。

3.2 橄欖苦苷較酸性環(huán)境中在堿性條件下容易分解，在pH為14時，橄欖苦苷將全部降解。

3.3 當提取物濃度為1.2mg/mL時，對亞鐵離子的螯合率約為20%，明顯低于EDTA（0.8mg/mL時，螯合率為96.7%）。

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