戚躍明，陳 濤

（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

紫芝是我國(guó)中藥學(xué)上的著名藥用真菌[1]。在《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定：紫芝（Ganoderma Sinense）和赤芝（Ganodema lucidum）為靈芝正品[2]。紫芝通常含有多種有效生物化學(xué)成分，如三萜類(lèi)化合物、甾體、生物堿、多糖等[3]。據(jù)報(bào)道：紫芝或靈芝類(lèi)多糖中的有效成分具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗癌等功效[4-6]。機(jī)體新陳代謝或外部條件刺激下機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量超氧化物陰離子、羥基自由基、過(guò)氧化氫（H2O2）和活性氧化物（ROS）。這些物質(zhì)的積累會(huì)導(dǎo)致許多相關(guān)疾病，如哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病和癌癥等[7]。紫芝和靈芝類(lèi)多糖的抗氧化活性已經(jīng)被大量研究證實(shí)，但以往大量的研究都集中在子實(shí)體中多糖的研究，對(duì)其液體發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖研究較少。該研究在研究紫芝深層發(fā)酵的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵上清液中胞外多糖組分進(jìn)行了分離純化，并對(duì)其抗氧化活性作了初步的研究，為尋找一種天然且具較強(qiáng)抗氧化活性的物質(zhì)，預(yù)防人體內(nèi)因自由基過(guò)度積累導(dǎo)致的各種疾病，以及紫芝多糖的綜合開(kāi)發(fā)提供了一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫芝（Ganoderma Sinense）菌 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心篩選保存；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 日和光公司；DEAE-52、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；無(wú)水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、過(guò)氧化氫、Tirs試劑、鹽酸等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BSZ-100自動(dòng)部分收集器 上海琪特分析儀器有限公司；BHL-B恒流泵 上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；HD-5紫外檢測(cè)儀 上海滬西分析儀器廠(chǎng)；722光柵分光光度計(jì) 無(wú)錫科達(dá)智能儀器廠(chǎng)；雷磁PHS-25 pH計(jì)、微量分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Sunrise酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫芝胞外多糖的制備[8]發(fā)酵物3500r/min離心去除菌體，發(fā)酵液濃縮后用4倍體積酒精沉淀，4℃靜置24h，最后離心、冷凍干燥得到粗多糖，作為實(shí)驗(yàn)樣品。

1.2.2 脫蛋白 本實(shí)驗(yàn)比較了Sevage法、聚酰胺法和活性炭法對(duì)紫芝多糖提取的影響。Sevage法[9]：2%粗多糖溶液（20mL）以體積比1∶4加入Svegae試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），混合振蕩30min，靜止20min，除去水層與溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)，在水層取樣測(cè)定蛋白質(zhì)含量及多糖含量。

聚酰胺（PA）法[10]：2%粗多糖溶液20mL，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g聚酰胺粉，攪勻，室溫?fù)u床振蕩3h后抽濾，分別測(cè)定濾液中蛋白質(zhì)含量及多糖含量。

活性炭（Active Carbon）法[10]：2%粗多糖溶液20mL，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g的活性炭粉，攪勻，室溫?fù)u床振蕩3h后抽濾，分別測(cè)定濾液蛋白質(zhì)含量及多糖含量。

1.2.3 測(cè)定方法

1.2.3.1 多糖含量測(cè)定 多糖=總糖-還原糖，多糖損失率為多糖溶液經(jīng)工藝處理后多糖的變化量與原溶液中多糖含量的比值；測(cè)定總糖采用苯酚-硫酸法[11]，測(cè)定還原糖采用DNS光度法[12]。

1.2.3.2 蛋白測(cè)定方法 測(cè)定蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[13]；蛋白去除率為粗糖溶液脫蛋白處理后蛋白的變化量與原溶液中蛋白含量的比值。

1.2.4 DEAE-52離子交換色譜柱分級(jí)[14]將脫蛋白后冷凍干燥的粗多糖樣品100mg溶于3mL Tirs-HCl（pH6.5 50mmol/L）緩沖液后，利用DEAE-52離子交換柱（2.6cm×40cm），以Tirs-HCl（pH6.5 50mmol/L）為緩沖體系，Tirs-HCl緩沖液、0.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，其中NaCl均用Tirs-HCl（pH6.5 50mmol/L）緩沖液配制。自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，流速為1mL/min、5mL/管，以苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)每管洗脫液A490值，以A490對(duì)洗脫管數(shù)做洗脫曲線(xiàn)圖。

1.2.5 紫外光譜分析[15]取紫芝多糖GSP1、GSP2、GSP3，用雙重蒸餾水配成質(zhì)量濃度為1mg/mL的多糖溶液，以雙重蒸餾水作為對(duì)照，置于紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)下，在200～550nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描。

1.2.6 多糖抗氧化性的研究

1.2.6.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 以對(duì)DPPH自由基的清除能力[16]來(lái)衡量紫芝多糖的抗氧化能力。反應(yīng)體系為100μL多糖溶液，100μL現(xiàn)用現(xiàn)配制的0.2mg/mL DPPH乙醇溶液和100μL 95%乙醇充分混勻，黑暗反應(yīng)30min，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度。空白組用100μL 95%乙醇代替DPPH溶液，對(duì)照組為100μL DPPH溶液與200μL 95%乙醇混合。反應(yīng)體系吸光度越低，說(shuō)明清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)，DPPH自由基清除率的計(jì)算公式為：

式中，I表示DPPH·清除率；Ai表示樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度；Ac為對(duì)照組吸光度。

1.2.6.2 清除·OH能力的測(cè)定 ·OH的清除率的測(cè)定用Fenton法（Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH）[17]：反應(yīng)體系（3mL）包括1mL 1.5mmol/L的FeSO4，0.7mL 6mmol/L H2O2，0.3mmol/L 20mmol/L水楊酸鈉和樣品（0～10mg/mL），37℃孵育1h，562nm下測(cè)定吸光度確定羥基含量。用VC替換樣品作為對(duì)照組，自由基去除率可用以下公式計(jì)算：

式中，I表示·OH清除率；A0為對(duì)照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為空白組吸光度（不加反應(yīng)液）。

1.2.6.3 清除過(guò)氧化氫能力的測(cè)定 過(guò)氧化氫清除率的測(cè)定方法[18]為：混合H2O2（1.0mL，0.1mmol/L）和不同濃度濃縮后的樣品，再添加100μL 3%的鉬酸銨，10mL H2SO4（2mol/L）和7.0mL KI（1.8mol/L），用Na2S2O3硫代硫酸鈉（5mmol/L）滴定混合物至黃色消失。過(guò)氧化氫清除率計(jì)算公式如下：

式中，I表示過(guò)氧化氫清除率；V0為Na2S2O3滴定不添加樣品的混合物后的消耗量；V1為Na2S2O3添加樣品后的滴定量。

1.2.6.4 清除超氧化物陰離子自由基能力的測(cè)定[18]超氧自由基在PMS-NADH系統(tǒng)中引發(fā)，PMS-NADH體系包括10mol/L PMS，100μmol/L NADH和600μmol/L NBT（由pH7.8的0.1mol/L PBS配制）。560nm下混合體系室溫孵育5min后作為空白組，在添加PMS之前加入不同濃度的樣品，對(duì)照組中用Tirs-HCl緩沖液代替樣品?？钩趸镪庪x子自由基能力由以下公式計(jì)算得出：

式中，I表示超氧陰離子清除率；A0為空白對(duì)照組吸光度；A1為樣品組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液多糖得率

通過(guò)方法1.2.3.1和1.2.1確定發(fā)酵液中粗多糖含量為3.03g/L，醇沉后冷凍干燥后得到粗多糖含量為2.89g/L，醇沉的得率為95.4%。

2.2 三種試劑的脫蛋白效果

2.2.1 Sevag法脫蛋白測(cè)定結(jié)果 由圖1可知，Sevag脫蛋白隨著處理次數(shù)的增加，蛋白的去除率逐漸增加，當(dāng)處理5次以上時(shí)蛋白去除率基本保持在76.3%左右，而處理2次以上時(shí)多糖損失率基本保持在28.9%左右。由此得較佳的處理次數(shù)為5次。

圖1 Sevag法脫蛋白結(jié)果Fig.1 Result of removing protein by sevag method

2.2.2 活性炭脫蛋白法測(cè)定結(jié)果 由圖2可知，活性炭的最佳添加量為0.5g，蛋白去除率可達(dá)到70.3%，隨著活性炭添加量的增加，蛋白去除率增加非常緩慢，而多糖損失率卻陡然增加。說(shuō)明此法對(duì)多糖的最終得率影響比較大。

圖2 活性炭脫蛋白的結(jié)果Fig.2 Result of removing protein by active carbon method

2.2.3 聚酰胺（PA）脫蛋白法測(cè)定結(jié)果 由圖3可知，聚酰胺相對(duì)于前兩者的脫蛋白的效果更佳，在添加量達(dá)到1.5g時(shí)，蛋白去除率已達(dá)到86.3%，而多糖的損失率僅為25.6%。而后隨著聚酰胺的添加量的增加，蛋白去除率增加緩慢，基本維持不變，而多糖損失率卻呈緩慢增加趨勢(shì)。因此采用聚酰胺法脫蛋白較為合理。

圖3 聚酰胺（PA）脫蛋白的結(jié)果Fig.3 Result of removing protein by polyamide method

2.3 紫芝胞外多糖的分離純化結(jié)果

紫芝胞外粗多糖通過(guò)去除雜質(zhì)、復(fù)溶，DEAE-52離子交換柱層析，緩沖液和含0.1、0.2mol/L NaCl的緩沖溶液階段洗脫，分別得到三個(gè)多糖組分GSP1、GSP2、GSP3（見(jiàn)圖4）。

圖4 紫芝胞外多糖DEAE-52層析柱洗脫曲線(xiàn)Fig.4 Result of anion-exchange elution curve showinng the separation of GSP1，GSP2，GSP3 on DEAE-52

圖4表明紫芝胞外多糖洗脫曲線(xiàn)含有三個(gè)洗脫峰（由于洗脫液NaCl濃度達(dá)到0.3mol/L后就無(wú)明顯特征洗脫峰出現(xiàn)，所以圖4中省略了該部分洗脫曲線(xiàn)圖），根據(jù)其洗脫曲線(xiàn)圖可以計(jì)算出GSP1、GSP2、GSP3的分別占總糖的67.7%、18.1%、14.1%。

2.4 紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

圖5 三種多糖GSP1、GSP2、GSP3全波長(zhǎng)掃描結(jié)果Fig.5 Result of absorption spectrum of GSP1，GSP2 and GSP3

由圖5可知，多糖GSP1、GSP2、GSP3樣品在260～280nm處均無(wú)吸收峰，確定樣品不含蛋白質(zhì)。三種多糖在517、562nm等波長(zhǎng)附近吸光度接近零，因此對(duì)多糖抗氧化性的測(cè)定不形成干擾。

2.5 多糖抗氧化性結(jié)果

2.5.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定結(jié)果 圖6表明紫芝發(fā)酵液中分離得到的三種多糖均具有清除DPPH自由基的能力，其中GSP2的清除效果最佳，當(dāng)樣品中含量達(dá)到1.6mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到了76.3%，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；而GSP1和GSP3的DPPH自由基去除能力相對(duì)較弱。該多糖對(duì)DPPH自由基有清除能力可能是由于多糖中的羥基具有供氫質(zhì)體能力的結(jié)果。

圖6 清除DPPH自由基能力測(cè)定結(jié)果Fig.6 DPPH radical-scavenging activity of GSP1，GSP2 and GSP3

2.5.2 清除·OH能力的測(cè)定結(jié)果 羥自由基清除能力是抗氧化劑抗氧化活性的指標(biāo)之一。圖7表明三種多糖均具有清除·OH的能力，其中當(dāng)GSP2的量達(dá)到5mg/mL以上時(shí)，·OH清除率達(dá)到了81.5%以上，此時(shí)GSP3的羥基自由基清除率也達(dá)到了39.46%。GSP1的·OH清除率較前兩者顯弱。

圖7 清除·OH能力測(cè)定結(jié)果Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activities of GSP1，GSP2 and GSP3

2.5.3 清除過(guò)氧化氫能力的測(cè)定結(jié)果 由圖8得到，紫芝多糖GSP2的過(guò)氧化氫清除率明顯高于GSP1和GSP3，當(dāng)含量達(dá)到10mg/mL時(shí)，GSP2的過(guò)氧化氫清除率達(dá)到了48.12%，此時(shí)GSP1和GSP3的過(guò)氧化氫清除率分別是20.77%、26.81%。

圖8 清除過(guò)氧化氫能力測(cè)定結(jié)果Fig.8 The hydrogen peroxide scavenging activities of GSP1，GSP2 and GSP3

2.5.4 清除超氧化物陰離子自由基能力的測(cè)定結(jié)果圖9表明紫芝胞外多糖GSP2具有較強(qiáng)的抗超氧化物陰離子自由基的能力，當(dāng)含量為9mg/mL時(shí)，其超氧化物陰離子自由基的清除率為47.4%；該濃度下GSP1的超氧化物陰離子自由基的清除率僅為3.29%，GSP3的超氧化物陰離子自由基的清除率為21.7%。GSP2可能具有一定數(shù)量的羥基或酚式羥基，它會(huì)通過(guò)增加自身電子云密度來(lái)奪取超氧化物的電子，然后該羥基轉(zhuǎn)向多糖分子內(nèi)，從而達(dá)到抗超氧化物陰離子的作用；而GSP1和GSP3可能是具有較強(qiáng)的分子內(nèi)或分子間氫鍵使其抗超氧化物陰離子的能力減弱或消失。

圖9 清除超氧化物陰離子基能力測(cè)定結(jié)果Fig.9 Superoxide anion radicalscavenging activities of GSP1，GSP2 and GSP3

3 結(jié)論

通過(guò)聚酰胺法脫蛋白后的紫芝胞外粗多糖，經(jīng)DEAE-52陰離子色譜柱梯度洗脫得到三種胞外多糖組分，經(jīng)體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)研究確定GSP2為主要功效成分，GSP2表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化和去除自由基等能力，明顯強(qiáng)于其他兩種組分。紫芝胞外抗氧化活性多糖GSP2的確定深化了紫芝胞外抗氧化活性物質(zhì)的探索，也為未來(lái)充分利用自然資源提供了一種方法。后續(xù)的研究應(yīng)該對(duì)紫芝胞外多糖GSP2的體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行研究深化，為尋找真正適合于人體的抗氧化活性物質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，從而能夠更好地挖掘著名傳統(tǒng)中藥紫芝的藥用功效。

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