曲宏宏，段文艷，唐學(xué)燕，陳 潔，曾茂茂，黃小林

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

米糠是大米加工過程中的主要副產(chǎn)物，卻匯集了稻谷近70%的營養(yǎng)物質(zhì)，包括多種人體需要的營養(yǎng)素，是一種極具開發(fā)價值的農(nóng)產(chǎn)品原料。然而在通常條件下，米糠極易氧化酸敗，產(chǎn)生不良風(fēng)味，影響了米糠產(chǎn)品在食品工業(yè)和保健品中的開發(fā)和利用。目前針對米糠風(fēng)味物質(zhì)的研究，國內(nèi)外均鮮有報道。Phoka等利用靜態(tài)頂空氣質(zhì)聯(lián)用法（HS-GC-MS）從米糠中鑒定出了11種揮發(fā)性成分，并與傳統(tǒng)的過氧化值（POV）檢測方法進(jìn)行了對比研究[1]，但并未對米糠揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取方法進(jìn)行深入研究。目前，采用不同提取方法進(jìn)行食品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究較多，如靜態(tài)頂空萃取法（SHS）用于分析肉類風(fēng)味[2]，加速溶劑萃取法（ASE）用于魚類風(fēng)味研究[3]，同時蒸餾萃取法（SDE）用于香腸、龍蝦風(fēng)味的研究[4]，以及固相微萃取法（SPME）用于酒類[5]、果汁類[6]、奶類[7]、油類[8]、調(diào)味品類[9]、菌類[10]和植物[11]等的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究。為了控制米糠風(fēng)味劣變，提高米糠利用價值，首先必須要了解米糠風(fēng)味的組成。因此，本文研究了米糠風(fēng)味的測定方法，并重點探討了四種風(fēng)味物質(zhì)的采集方法，包括靜態(tài)頂空萃取法、加速溶劑萃取法、同時蒸餾萃取法和固相微萃取法對風(fēng)味物質(zhì)測定的影響，初步探討了可檢測到的揮發(fā)性米糠風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)，以期為米糠風(fēng)味成分的分析和檢測方法的確定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠 選用的水稻品種為水稻9031（空育131），由益海嘉里佳木斯糧油工業(yè)有限公司提供，采樣后立即真空包裝冷凍保藏。

SPME手動進(jìn)樣手柄、75μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS和100μm PDMS萃取頭 美國Supelco公司；SDE裝置和Oldershow濃縮柱 江南大學(xué)國家食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室定制；Trace GC 2000/Trace MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Finnigan公司；ASE100加速溶劑萃取裝置 美國戴安公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑制備方法 重蒸乙醚：分析純乙醚經(jīng)Oldershaw濃縮柱蒸餾，去掉前后30mL餾分、保留中間乙醚餾分備用。無水硫酸鈉：550℃灼燒分析純Na2SO4，3h，冷卻，干燥器內(nèi)存放備用。

1.2.2 揮發(fā)性成分提取方法

1.2.2.1 靜態(tài)頂空法 取3g新鮮米糠置于22mL頂空瓶中，將頂空瓶放在40℃烘箱中平衡40min后抽取1μL頂空氣體進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2.2 加速溶劑萃取法 稱取3g新鮮米糠放入萃取池中，置于轉(zhuǎn)盤上。加入二氯甲烷作為萃取溶劑，在溫度80℃，壓力為1.5MPa的條件下萃取10min。萃取液過0.45μm的有機(jī)相濾膜后進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2.3 同時蒸餾萃取法 原料50g，蒸餾水300g，置于500mL圓底燒瓶中接SDE裝置的右端，用電熱套加熱保持溫度在90℃左右，將內(nèi)裝50mL重蒸乙醚的100mL的圓底燒瓶左端與SDE連接，恒溫水浴60℃加熱沸騰1h。加入活化后的適量無水硫酸鈉至萃取溶劑中，冷藏過夜。過濾、濃縮（Oldershaw柱，50℃水浴，分流比為10∶1），當(dāng)瓶內(nèi)的溶劑少于1mL時，停止加熱，靜置使柱內(nèi)的溶劑滴下來。用洗耳球?qū)饪s液吹至1mL，供GC-MS分析鑒定。

1.2.2.4 固相微萃取法 稱取3g米糠樣品置于15mL頂空瓶中用硅樹脂隔膜密封，將樣品瓶置于60℃水浴中進(jìn)行頂空揮發(fā)性組分平衡，選用SPME手動進(jìn)樣手柄，萃取頭選擇75μm CAR/PDMS[12]。將已老化好的指定萃取頭插入頂空瓶中吸附40min。將吸附好的萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，供GC-MS分析鑒定，解吸溫度250℃，解吸時間為5min。

1.2.3 測定條件

1.2.3.1 色譜條件 PEG-20M毛細(xì)管柱（30m×0.25mm），液膜厚度為0.25μm；在40℃恒溫4min后，以5℃/min的速率升溫至100℃，繼續(xù)以8℃/min的速率升溫至230℃并保持8min。進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣為氦氣，流速為0.8mL/min，不分流。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電離方式為EI+，離子源溫度為200℃，接口溫度為250℃，m/z掃描范圍為33～450amu，電子能量70eV，燈絲發(fā)射電流為200μA。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗中分析揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)由Xcalibur軟件完成，未知化合物經(jīng)計算機(jī)檢索同時與NIST譜庫和Wiley譜庫相匹配，當(dāng)正反匹配度大于800，鑒定結(jié)果才予以報道?；衔镆韵鄬Ψ迕娣e作為半定量結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 四種方法提取的風(fēng)味物質(zhì)分析

圖1 不同提取方法條件下米糠揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of the volatile flavor components of rice bran by different extraction methods

不同的樣品前處理方式對風(fēng)味物質(zhì)的分析有較大影響，不同的方法適合于不同的樣品。通常SHS法適合于極易揮發(fā)或揮發(fā)性組分含量較高的樣品[13]；ASE法主要是利用風(fēng)味化合物與水溶性基質(zhì)極性的差別進(jìn)行分離萃取，適用于極性揮發(fā)性物質(zhì)的測定；SDE法先將揮發(fā)性物質(zhì)從待測樣品中蒸餾出來，再將水溶性的餾分進(jìn)行溶劑萃取，操作相對復(fù)雜，易造成風(fēng)味物質(zhì)的損失，耗時稍長且高溫蒸汽作用易導(dǎo)致初始風(fēng)味的變化，但該方法便于加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析[14]；SPME法利用聚合纖維萃取頭直接吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，操作簡便、快捷，但是分析結(jié)果與萃取頭的吸附特性有很大關(guān)系[15]。

四種方法提取米糠揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流圖如圖1所示。比較四種方法得到的同一樣品的整體風(fēng)味組成，SPME方法出峰物質(zhì)最多，檢出51種化合物，且在保留時間上分布較寬。SDE方法檢出33種化合物。SHS法檢出22種化合物，得到的組分保留時間相對靠后。ASE方法獲得的揮發(fā)性成分過少，只檢出8種化合物，該方法顯然不適合測定米糠揮發(fā)性化合物，因此后續(xù)討論將不再討論該方法。進(jìn)一步分析其他三種方法得到的米糠風(fēng)味組分差異，可以看出不同前處理方法對于各類揮發(fā)性成分萃取的特異性和廣譜性。對圖譜進(jìn)行面積歸一法統(tǒng)計，計算圖譜中各類風(fēng)味物質(zhì)的峰面積及占總出峰物質(zhì)的相對比例，匯總結(jié)果如表1所示。

為了進(jìn)一步分析四種樣品前處理方法對于米糠風(fēng)味成分的提取效果，我們將所提取到的成分按照醛類、酸類、酯類、醇類、酮類、苯類以及雜環(huán)類等六大類對風(fēng)味有顯著影響的成分進(jìn)行深入分析。

2.1.1 醛類化合物 SDE法未檢出醛類化合物，SHS法檢出三種醛類物質(zhì)，SPME法檢出四種醛類物質(zhì)。在SHS檢測結(jié)果中醛類化合物的相對百分含量為2.6%，其中反式-2，4-癸二烯醛相對百分含量為1.7%；SPME法檢測到的醛類化合物相對百分含量為7.6%，其中己醛的相對百分含量為4.7%，壬醛的相對百分含量為1.6%。

己醛和反式-2，4-癸二烯醛都是亞油酸的氧化產(chǎn)物，亞油酸的自氧化產(chǎn)生亞油酸9-和13-氫過氧化物，13-氫過氧化物斷裂生成己醛[16]，脂類在低溫氧化過程中會產(chǎn)生大量己醛，9-氫過氧化物斷裂生成2，4-癸二烯醛，進(jìn)一步受熱轉(zhuǎn)化生成更加穩(wěn)定的反式-2，4-癸二烯醛[17]。己醛表現(xiàn)為生的油脂氣味和青草氣味，反式-2，4-癸二烯醛呈現(xiàn)的也是脂肪氣味，壬醛則呈現(xiàn)脂肪氧化酸敗的哈喇味。

2.1.2 酸類化合物 三種方法均檢出酸類化合物，SHS法檢出的種類最多，共有8種，其相對百分含量共為68.7%；SPME法檢出5種，其相對百分含量共為2.1%；SDE法僅檢出1種，其相對百分含量為14.8%。

SHS法和SDE法都檢出乙酸，SPME法并未檢出乙酸；SHS方法中檢測出較高含量的反式油酸和亞油酸，相對百分含量分別為49.3%和18.5%，分析其來自米糠本身大量的油酸和亞油酸，反式油酸是油酸的一種單不飽和反式異構(gòu)體；此外，SHS法和SPME法共同檢出一些分子量相對較小的酸類化合物，如壬酸、己酸、庚酸；除此之外，SPME法還檢出了異戊酸和丁酸，SHS法檢出了辛酸。

丁酸、己酸呈現(xiàn)強(qiáng)烈的酸敗氣味[18]，異戊酸表現(xiàn)出難聞的汗臭氣味[19]，這些小分子酸類化合物，通常由米糠脂肪中的甘油三酯和磷脂水解得到；辛酸表現(xiàn)為酸敗臭，可能是由相應(yīng)的醇、醛等化合物氧化而來。

2.1.3 酯類化合物 三種方法都檢出了酯類化合物，SHS檢出酯類化合物最多，共有9種，其相對百分含量為11.7%；SPME共檢出8種，其相對百分含量為16.5%；SDE共檢出5種，其相對百分含量為16%。

酯類化合物通常呈現(xiàn)出的是水果或油脂中令人愉快的芳香物質(zhì)，米糠中的脂肪酸可經(jīng)過氧化合成部分芳香的酯類物質(zhì)，貢獻(xiàn)米糠的部分風(fēng)味。

2.1.4 醇類化合物 比較三種檢測方法發(fā)現(xiàn)，只有SDE法和SPME法檢出了醇類化合物，分別檢出2種和8種，占每種方法檢出物的相對百分含量分別是4.4%和9.4%。

SPME法檢出的醇類化合物比例較高，醇類的產(chǎn)生可能來自于脂肪酸的二級氫過氧化物的分解[20]，脂質(zhì)氧化酶對脂肪酸的作用[21]，脂肪的氧化分解或羰基化合物的還原[22]，脫氫酶也可以將一些脂肪酸和氨基酸生成的醛還原成相應(yīng)的醇[17]。

醇類也能呈現(xiàn)一定的風(fēng)味，例如1-辛烯-3-醇具有蘑菇、青草氣味，可能源自米糠中亞油酸的氧化裂解[23]。

2.1.5 酮類化合物 酮類也是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，三種方法中只有SPME法檢出了酮類化合物，共檢出7種，占全部檢出物相對百分含量的10%，其中丙酮的相對百分含量較高，約占4.1%，此外2-丁酮、2-癸酮的相對百分含量分別為1.8%和2%，這三種物質(zhì)均呈現(xiàn)類似酸臭的氣味，因此，可能參與構(gòu)成米糠的不良風(fēng)味。

2.1.6 苯類化合物及雜環(huán)類化合物 SPME法共檢出6種苯類化合物，占總出峰物質(zhì)的百分含量約為44%；苯類化合物主要呈現(xiàn)的是芳香型氣味，因此推測新鮮米糠自身攜帶的清香可能主要來自苯類化合物的風(fēng)味。其他兩種方法均未檢出苯類化合物。

此外，SPME法還檢出一些雜環(huán)類化合物，如2-正戊基呋喃，已被初步認(rèn)定為亞油酸的一種氧化產(chǎn)物，該物質(zhì)閾值較低為4×10-9g/mL[24]，可提供類似甘草的氣味[25]。

通過對三種方法獲得的各類檢出物的分析，并與米糠感官氣味的對比，初步判斷米糠特有的清香氣味與類似脂肪的氣味可能由苯類物質(zhì)、酯類物質(zhì)貢獻(xiàn)較多，米糠呈現(xiàn)的類似糠臭的不良?xì)馕秳t主要來源于氧化產(chǎn)物醛、酸、醇、酮及雜環(huán)類化合物。

2.2 SHS、SDE和SPME三種方法的比較

從表1中的結(jié)果結(jié)合上述分析可知，SDE法對于提取相對較高沸點的烷烴和酯類具有特別優(yōu)勢，但該方法會導(dǎo)致低沸點化合物如醛、酮、酸和部分酯類物質(zhì)的損失，另外提取過程溫度較高、時間較長，可能會發(fā)生水解、氧化、酯化或分解等反應(yīng)，從而導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果的偏差，因此不適合米糠這種易于氧化體系中風(fēng)味物質(zhì)的檢測。

SHS法是一種非濃縮型的方法，適合分析揮發(fā)性較強(qiáng)、濃度比較高的物質(zhì)。本實驗中只檢出了酸類、醛類、酯類及烷烴類四類化合物，因此貢獻(xiàn)米糠風(fēng)味的化合物檢出有限。

表1 SDE、SHS和SPME三種方法萃取風(fēng)味物質(zhì)的比較Table 1 Comparison in flavor components extracted by SDE，SHS and SPME

續(xù)表

SPME法萃取條件溫和，揮發(fā)性物質(zhì)的破壞與損失也比較小，可檢出成分大大多于其他兩種方法，除個別風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)如辛酸、反-2，4-癸二烯醛等未檢出外，大部分貢獻(xiàn)米糠風(fēng)味的特征化合物都可在該方法中檢出。盡管這種方法對高沸點的烷烴類和酯類提取能力較弱，但鑒于這些高沸點成分對米糠風(fēng)味貢獻(xiàn)有限，該方法比較適合于米糠風(fēng)味物質(zhì)的檢測。

3 結(jié)論

綜上所述，在四種常用的風(fēng)味物質(zhì)提取方法中，ASE法、SDE法和SHS法均不適合用于米糠揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測，而SPME法從檢測的風(fēng)味物質(zhì)種類、數(shù)量、總峰面積、對米糠總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)及可操作性方面均優(yōu)于其他三種方法，因此，SPME法可作為米糠風(fēng)味物質(zhì)快速簡便的采集方法，再配合GC-MS，可以對米糠風(fēng)味進(jìn)行較好的定性和定量分析。

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