高效液相色譜法快速測定紫貽貝中的?；撬?/h1>
2013-12-08 06:44:48鄭平安張春丹蘇秀榕
食品工業(yè)科技 2013年4期
張 亮，劉 文，鄭平安，黃 健，李 曄，張春丹，蘇秀榕，*
（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211；2.北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，北京101200）
?；撬幔═aurine），又稱β-氨基乙磺酸，是一種非蛋白結(jié)構(gòu)的含硫氨基酸，在魚貝類尤其是軟體動(dòng)物中含量十分豐富[1]。?；撬釋θ梭w起十分重要的生理調(diào)節(jié)功能，在促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育[2]、提高學(xué)習(xí)記憶能力[3]及延緩衰老[4]等方面具有重要調(diào)節(jié)作用，特別是對嬰幼兒的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[5-6]。據(jù)報(bào)道，貝類中馬氏珠母貝中?；撬岷扛哌_(dá)13830mg/kg[7]，牡蠣中?；撬岷恐辽僖灿?000mg/kg[1]，紫貽貝中?；撬岷肯鄬Φ鸵恍策_(dá)到4400mg/kg[1]。目前以上三種貝類的市場價(jià)格，馬氏珠母貝和牡蠣平均價(jià)分別為60元/kg和40元/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紫貽貝2元/kg這一低廉的價(jià)格?？梢?，紫貽貝作為一種廉價(jià)的?；撬醽碓从衅鋸V泛的市場價(jià)值。隨著?；撬嵫芯考皯?yīng)用的迅速發(fā)展，?；撬岫繖z測的方法也急待建立和改進(jìn)。目前?；撬岬臏y定方法主要有分光光度計(jì)法[8]、薄層層析法[9]、氨基酸自動(dòng)分析法[10-11]和高效液相色譜法[12-13]等。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜法因其樣品預(yù)處理簡單，方法準(zhǔn)確度、精確度及靈敏度較高，在測定食品和生物組織中牛磺酸含量的應(yīng)用中日益廣泛[14-16]。其中，柱前衍生高效液相色譜法是高效液相色譜法測定?；撬岜容^常用的方法之一[1]，只需在一般的HPLC儀器上使用普通的反相柱子就可以進(jìn)行?；撬岬臏y定。其中，鄰苯二甲醛（OPA）作為柱前衍生反應(yīng)試劑在實(shí)際中應(yīng)用較多[17-19]。而國內(nèi)目前利用OPA柱前衍生高效液相色譜法測定紫貽貝中?；撬釀t尚未見報(bào)道，章超樺等[20]利用氨基酸分析儀分析了翡翠貽貝游離氨基酸的組成及含量。本研究利用OPA柱前衍生—高效液相色譜法測定紫貽貝中的牛磺酸，方法簡便、快速，為高效、準(zhǔn)確的牛磺酸分析及其方法建立提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
紫貽貝（Mytilus edulisLinnaeus） 購于寧波市江北區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，開殼后取肉，勻漿、分裝，置-20℃冷凍備用；甲醇、乙腈 均為色譜純；牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；硼酸、氫氧化鈉、磺基水楊酸 均為分析純；鄰苯二甲醛（OPA）、乙硫醇 均為化學(xué)純；0.4mol/L硼酸鈉緩沖液 稱取2.48g硼酸和1.41g氫氧化鈉，用水定容至100mL；衍生劑 稱取0.1g鄰苯二甲醛（OPA）用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100mL。
1200型高效液相色譜儀、Agilent Zorbax 300BC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色譜柱、G1321A熒光檢測器 美國Agilent公司；CQ25-12D超聲儀 寧波江南儀器廠。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樣品預(yù)處理 稱取紫貽貝3.0g，加10.0mL雙蒸水加熱煮沸10min，再超聲萃取15min，定容至50mL。充分混勻后，樣液于4000r/min離心10min，吸取2.0mL上述上清液于4mL離心管中，再加2.0mL 60g/L磺基水楊酸，離心10min，將此時(shí)的上清液轉(zhuǎn)移至10mL小燒杯中，滴加1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性，用水定容至25.0mL，待衍生用。
1.2.2 柱前衍生化反應(yīng) 吸取1.0mL上述定容液于4mL離心管中，再準(zhǔn)確加入1.0mL衍生劑搖勻，置暗處反應(yīng)2min后，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，立即進(jìn)樣20μL，進(jìn)行HPLC分析，測定其峰面積，所有試樣及標(biāo)準(zhǔn)溶液從反應(yīng)至進(jìn)樣的時(shí)間應(yīng)保持一致，并控制在5min以內(nèi)。
1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇+乙腈+水（10∶10∶80，v/v/v）；流速0.8mL/min；進(jìn)樣量：20μL；熒光檢測器（FLD）波長：Ex330nm，Em530nm；柱溫：30℃。
1.3 定量測定
標(biāo)準(zhǔn)曲線：用0.02mg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/mL的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，對所得各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生反應(yīng)后進(jìn)樣20μL進(jìn)行測定。
采用外標(biāo)定量。樣品中的?；撬岷扛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。
1.4 回收率測定
在同一樣品中加入一定量的?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣測定，以考察方法的準(zhǔn)確度。
2 結(jié)果與分析
2.1 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
根據(jù)不同質(zhì)量濃度?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液的出峰面積，以?；撬豳|(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（見圖1）。?；撬針?biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示。
圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of taurine
圖2 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 The HPLCchromatogram of taurine standard solution
由圖1可知，?；撬嵩?.0～20.0μg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性回歸方程為：Y=45.954X+5.862，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。結(jié)果表明，?；撬嵩诖速|(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由圖2可知，?；撬岬谋Ａ魰r(shí)間為6.752min，出峰較快，為快速檢測提供了基礎(chǔ)。
2.2 回收率測定
同一樣品分別加入不同質(zhì)量濃度的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，各加標(biāo)量平行測定5次，利用差減法求出牛磺酸的回收率（見表1）。結(jié)果表明，此方法的平均回收率為98.71%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.57%。
表1 回收率測定結(jié)果Table 1 Recovery test of samples
2.3 精密度測定
同一樣品重復(fù)測定6次，峰面積見表2，所測峰面積平均值為749.134±17.770，RSD為2.37%。
2.4 樣品的測定
按1.2.1和1.2.2方法處理樣品，三次平行樣測定結(jié)果及計(jì)算值見表3。由換算結(jié)果知，OPA柱前衍生高效液相色譜法測得該紫貽貝樣品中牛磺酸的平均質(zhì)量濃度為17.633μg/mL，換算到原料中?；撬岬钠骄|(zhì)量濃度為3673.631mg/kg。
表2 精密度測定結(jié)果Table 2 The result of precision test
表3 紫貽貝中牛磺酸含量Table 3 The taurine content of Mytilus edulis Linnaeus
3 討論與結(jié)論
牛磺酸以游離氨基酸的形式普遍存在于水產(chǎn)品的體內(nèi)組織和浸出液以及煮汁中[21]，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于熱水中[22]。錢愛萍等[23]比較研究了6%磺基水楊酸熱水浴提取法、0.02mol/L鹽酸提取法、70%乙醇沸水浴提取法三種從海產(chǎn)品中提取牛磺酸的前處理方法，結(jié)果顯示，用6%磺基水楊酸熱水浴法提取?；撬釡y定值最高。高加龍等[24]采用偏磷酸溶液溶解馬氏珠母貝肉，并經(jīng)超聲振蕩可進(jìn)一步提取樣品中的?；撬帷１緦?shí)驗(yàn)中的樣品預(yù)處理采用熱水浴結(jié)合超聲振蕩來提取紫貽貝中的牛磺酸，并選用60g/L磺基水楊酸作為沉淀劑來沉淀提取液中可溶性蛋白，去除蛋白的干擾。從樣品的測定結(jié)果來看，該樣品前處理方法可有效提取紫貽貝樣品中的?；撬?，且操作簡單，實(shí)驗(yàn)中測得紫貽貝中?；撬岬暮客延形墨I(xiàn)[1]中報(bào)道紫貽貝中牛磺酸的含量4400mg/kg較為接近。
使用OPA作為柱前衍生反應(yīng)試劑的優(yōu)點(diǎn)在于它與牛磺酸衍生反應(yīng)所需時(shí)間短，然而，由于其與?；撬嵘傻呐；撬嵫苌锓€(wěn)定時(shí)間較短，因此準(zhǔn)確控制衍生反應(yīng)時(shí)間是測定的關(guān)鍵?？刂品磻?yīng)至進(jìn)樣的時(shí)間和操作的一致性，可排除衍生物穩(wěn)定時(shí)間短對測定結(jié)果的影響。
以甲醇∶乙腈∶水（10∶10∶80，v/v/v）為流動(dòng)相，在激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長530nm條件下，平均回收率為98.71%，RSD為1.57%。OPA柱前衍生高效液相色譜法可快速測定紫貽貝中的?；撬?，且只需要簡單的預(yù)處理就可以衍生上樣分析，并且分析時(shí)間短，線性好，靈敏度較高。
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1 材料與方法
1.1 材料與儀器
紫貽貝（Mytilus edulisLinnaeus） 購于寧波市江北區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，開殼后取肉，勻漿、分裝，置-20℃冷凍備用；甲醇、乙腈 均為色譜純；牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；硼酸、氫氧化鈉、磺基水楊酸 均為分析純；鄰苯二甲醛（OPA）、乙硫醇 均為化學(xué)純；0.4mol/L硼酸鈉緩沖液 稱取2.48g硼酸和1.41g氫氧化鈉，用水定容至100mL；衍生劑 稱取0.1g鄰苯二甲醛（OPA）用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100mL。
1200型高效液相色譜儀、Agilent Zorbax 300BC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色譜柱、G1321A熒光檢測器 美國Agilent公司；CQ25-12D超聲儀 寧波江南儀器廠。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樣品預(yù)處理 稱取紫貽貝3.0g，加10.0mL雙蒸水加熱煮沸10min，再超聲萃取15min，定容至50mL。充分混勻后，樣液于4000r/min離心10min，吸取2.0mL上述上清液于4mL離心管中，再加2.0mL 60g/L磺基水楊酸，離心10min，將此時(shí)的上清液轉(zhuǎn)移至10mL小燒杯中，滴加1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性，用水定容至25.0mL，待衍生用。
1.2.2 柱前衍生化反應(yīng) 吸取1.0mL上述定容液于4mL離心管中，再準(zhǔn)確加入1.0mL衍生劑搖勻，置暗處反應(yīng)2min后，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，立即進(jìn)樣20μL，進(jìn)行HPLC分析，測定其峰面積，所有試樣及標(biāo)準(zhǔn)溶液從反應(yīng)至進(jìn)樣的時(shí)間應(yīng)保持一致，并控制在5min以內(nèi)。
1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇+乙腈+水（10∶10∶80，v/v/v）；流速0.8mL/min；進(jìn)樣量：20μL；熒光檢測器（FLD）波長：Ex330nm，Em530nm；柱溫：30℃。
1.3 定量測定
標(biāo)準(zhǔn)曲線：用0.02mg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/mL的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，對所得各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生反應(yīng)后進(jìn)樣20μL進(jìn)行測定。
采用外標(biāo)定量。樣品中的?；撬岷扛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。
1.4 回收率測定
在同一樣品中加入一定量的?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣測定，以考察方法的準(zhǔn)確度。
2 結(jié)果與分析
2.1 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
根據(jù)不同質(zhì)量濃度?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液的出峰面積，以?；撬豳|(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（見圖1）。?；撬針?biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示。
圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of taurine
圖2 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 The HPLCchromatogram of taurine standard solution
由圖1可知，?；撬嵩?.0～20.0μg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性回歸方程為：Y=45.954X+5.862，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。結(jié)果表明，?；撬嵩诖速|(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由圖2可知，?；撬岬谋Ａ魰r(shí)間為6.752min，出峰較快，為快速檢測提供了基礎(chǔ)。
2.2 回收率測定
同一樣品分別加入不同質(zhì)量濃度的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，各加標(biāo)量平行測定5次，利用差減法求出牛磺酸的回收率（見表1）。結(jié)果表明，此方法的平均回收率為98.71%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.57%。
表1 回收率測定結(jié)果Table 1 Recovery test of samples
2.3 精密度測定
同一樣品重復(fù)測定6次，峰面積見表2，所測峰面積平均值為749.134±17.770，RSD為2.37%。
2.4 樣品的測定
按1.2.1和1.2.2方法處理樣品，三次平行樣測定結(jié)果及計(jì)算值見表3。由換算結(jié)果知，OPA柱前衍生高效液相色譜法測得該紫貽貝樣品中牛磺酸的平均質(zhì)量濃度為17.633μg/mL，換算到原料中?；撬岬钠骄|(zhì)量濃度為3673.631mg/kg。
表2 精密度測定結(jié)果Table 2 The result of precision test
表3 紫貽貝中牛磺酸含量Table 3 The taurine content of Mytilus edulis Linnaeus
3 討論與結(jié)論
牛磺酸以游離氨基酸的形式普遍存在于水產(chǎn)品的體內(nèi)組織和浸出液以及煮汁中[21]，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于熱水中[22]。錢愛萍等[23]比較研究了6%磺基水楊酸熱水浴提取法、0.02mol/L鹽酸提取法、70%乙醇沸水浴提取法三種從海產(chǎn)品中提取牛磺酸的前處理方法，結(jié)果顯示，用6%磺基水楊酸熱水浴法提取?；撬釡y定值最高。高加龍等[24]采用偏磷酸溶液溶解馬氏珠母貝肉，并經(jīng)超聲振蕩可進(jìn)一步提取樣品中的?；撬帷１緦?shí)驗(yàn)中的樣品預(yù)處理采用熱水浴結(jié)合超聲振蕩來提取紫貽貝中的牛磺酸，并選用60g/L磺基水楊酸作為沉淀劑來沉淀提取液中可溶性蛋白，去除蛋白的干擾。從樣品的測定結(jié)果來看，該樣品前處理方法可有效提取紫貽貝樣品中的?；撬?，且操作簡單，實(shí)驗(yàn)中測得紫貽貝中?；撬岬暮客延形墨I(xiàn)[1]中報(bào)道紫貽貝中牛磺酸的含量4400mg/kg較為接近。
使用OPA作為柱前衍生反應(yīng)試劑的優(yōu)點(diǎn)在于它與牛磺酸衍生反應(yīng)所需時(shí)間短，然而，由于其與?；撬嵘傻呐；撬嵫苌锓€(wěn)定時(shí)間較短，因此準(zhǔn)確控制衍生反應(yīng)時(shí)間是測定的關(guān)鍵?？刂品磻?yīng)至進(jìn)樣的時(shí)間和操作的一致性，可排除衍生物穩(wěn)定時(shí)間短對測定結(jié)果的影響。
以甲醇∶乙腈∶水（10∶10∶80，v/v/v）為流動(dòng)相，在激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長530nm條件下，平均回收率為98.71%，RSD為1.57%。OPA柱前衍生高效液相色譜法可快速測定紫貽貝中的?；撬?，且只需要簡單的預(yù)處理就可以衍生上樣分析，并且分析時(shí)間短，線性好，靈敏度較高。
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