江 豐，汪志慧，朱曉玲，嚴(yán) 恒，黃 茜，曹 暉

（1.湖北省商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究中心，湖北武漢 430010；2.武漢生物工程學(xué)院，湖北武漢 430415）

富馬酸二甲酯（Dimethyl fumarate，DMF），是美國(guó)20世紀(jì)80年代開發(fā)出來(lái)的一種新型防腐劑。由于DMF具有毒性低、抑菌能力強(qiáng)、抑菌種類多、不受環(huán)境影響等特點(diǎn)，在我國(guó)被廣泛應(yīng)用于食品、糧食、飼料等的防腐、防霉及保鮮[1-2]。DMF易水解生成甲醇，長(zhǎng)期食用對(duì)肝、腎有很大的副作用，對(duì)人體尤其是兒童的成長(zhǎng)發(fā)育危害很大[3]。我國(guó)衛(wèi)生部在2009年2月6日公布的食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單中明確規(guī)定DMF不允許在食品中使用，但一些不法經(jīng)營(yíng)者仍違法將DMF用于食品的防腐[4]。目前衛(wèi)生部公布的DMF的檢測(cè)方法的檢測(cè)限高達(dá)25mg/kg，遠(yuǎn)不能滿足歐盟對(duì)產(chǎn)品中DMF的含量不應(yīng)超過0.1mg/kg的要求[5]，因此建立一種準(zhǔn)確、檢出限低的DMF的測(cè)定方法非常必要。目前DMF的檢測(cè)方法有薄層法[6]、液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14]和氣相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法[15-16]法，但將超聲波輔助提取和氣相色譜-三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜相結(jié)合檢測(cè)面包和餅干食品中DMF的方法未見報(bào)道。本文擬建立一種檢測(cè)限低、精密度好、回收率高的氣相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法來(lái)測(cè)定面包和餅干中DMF，為面包和餅干中DMF的檢測(cè)方法提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 SIGMA公司；丙酮、乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯 均為分析純；C18SPE小柱 安捷倫科技有限公司。

氣相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀TSQ Quantum XLS 賽默飛世爾科技；超聲洗滌儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.10g富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，配制成1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后以乙酸乙酯逐級(jí)稀釋成0.001、0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作系列。

1.3 樣品處理

稱取2.00g粉碎樣品于10mL具塞試管中，加入10mL乙酸乙酯，超聲波提取25min，靜止10min后，將上清液用裝有無(wú)水硫酸鈉的漏斗過濾至燒杯中，將濾液完全轉(zhuǎn)移至已用乙酸乙酯預(yù)淋過的C18SPE小柱中，再用5mL乙酸乙酯分兩次淋洗小柱，合并淋洗液，濃縮并定容至10mL，用GC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

色譜柱：TR-5 MS毛細(xì)管氣相色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；柱溫箱：70℃保持1min，以10℃/min的升溫速率升至150℃，再以25℃/min的升溫速率升至200℃，保持4min；進(jìn)樣口溫度：220℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；載氣流速：1.2mL/min；傳輸線溫度：230℃；進(jìn)樣量：1μL；離子源：EI源；離子源溫度：230℃；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）；掃描時(shí)間：4～6min；碰撞氣壓力：1.0mTorr；循環(huán)時(shí)間：0.3min。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 DMF總離子流色譜圖（0.050μg/mL）Fig.1 Total ion chromatogram of DMFstandard sample（0.050μg/mL）

圖2 DMF標(biāo)樣的一級(jí)質(zhì)譜圖（0.050μg/mL）Fig.2 The mass spectrum of standard DMF solution（0.050μg/mL）

2.1.1 富馬酸二甲酯的定性分析 通過全掃描方式觀察總離子流圖，得到目標(biāo)化合物的分子離子峰，在本方法的分析條件下，測(cè)得DMF特征色譜峰的保留時(shí)間為5.09min（見圖1）。對(duì)該色譜峰分析得到一級(jí)質(zhì)譜圖（見圖2），出現(xiàn)的特征性質(zhì)譜峰有：m/z59、85、113。與數(shù)據(jù)庫(kù)中DMF的質(zhì)譜圖基本吻合。

2.1.2 碰撞能量的優(yōu)化和特征離子的選擇 DMF在EI電離條件下，選定豐度值最大的m/z113碎片離子作為母離子，通過碰撞反應(yīng)進(jìn)行離子掃描，逐步加大碰撞能量，母離子豐度逐漸減少，子離子豐度逐漸增加。選用豐度較大的兩個(gè)離子m/z85、59分別作為定量和輔助定性離子（見圖3），并確定最佳碰撞能量的范圍，最后在SRM模式下進(jìn)一步調(diào)整碰撞能量，以獲得DMF的最大靈敏度。最終選擇的母離子、子離子和碰撞能量詳見表1。

圖3 DMF溶液的二級(jí)質(zhì)譜圖（0.050μg/mL）Fig.3 The second step mass spectrum of standard DMF solution（0.050μg/mL）

表1 檢測(cè)DMF的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrum conditions for the detection DMF

2.2 提取條件的優(yōu)化

圖4 提取溶劑對(duì)回收率的影響（n=3）Fig.4 Effect of different solvents on the recovery rate（n=3）

2.2.1 提取溶劑的選擇 文獻(xiàn)[17]報(bào)道，丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈溶液均可作為面包和餅干中DMF的提取溶劑。為了進(jìn)一步提高面包和餅干中DMF的回收率，在實(shí)驗(yàn)過程了分別用丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈溶液對(duì)含0.020μg/mL DMF的餅干樣品進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4中可知，三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈的回收率均較高，但從經(jīng)濟(jì)性、毒性等方面綜合考慮，最終選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。另外，由于樣液中含有一定量的油脂，所以有必要對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。本實(shí)驗(yàn)采用C18SPE小柱對(duì)油脂進(jìn)行吸附，回收結(jié)果表明，利用C18SPE小柱凈化樣品可以在保證回收率的同時(shí)減少油脂對(duì)色譜柱的污染損壞。

2.2.2 超聲提取時(shí)間的選擇 用10mL乙酸乙酯溶液對(duì)含0.020μg/mL DMF的餅干樣品進(jìn)行不同時(shí)間的超聲提取，從圖5可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，回收率逐漸上升，25min后基本達(dá)到平穩(wěn)。這是因?yàn)镈MF的擴(kuò)散需要一定的時(shí)間，適當(dāng)延長(zhǎng)超聲波提取時(shí)間，能使溶劑分布均勻；另外，提取過程中超聲波會(huì)產(chǎn)生一定的熱量[18]，這都將有利于回收率提高，但溫度過高會(huì)導(dǎo)致乙酸乙酯揮發(fā)，造成定量不準(zhǔn)確，綜合考慮以上因素，最終選擇的超聲提取時(shí)間為25min。

圖5 超聲提取時(shí)間對(duì)回收率的影響（n=3）Fig.5 Effect of ultrasound extracting time on the recovery rate（n=3）

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 重現(xiàn)性 在上述優(yōu)化條件下，分別將質(zhì)量濃度為0.005、0.010、0.050μg/mL的DMF標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）范圍分別為2.77%、1.11%和2.13%，結(jié)果表明，方法的重現(xiàn)性良好，能滿足檢測(cè)的要求。

2.3.2 方法的線性范圍 用乙酸乙酯配制DMF質(zhì)量濃度為0.001～1.00μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)行測(cè)定。以峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得到線性方程y=8.42134×106x+19364.4，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，且線性范圍廣。

以信噪比S/N=3時(shí)所對(duì)應(yīng)的DMF質(zhì)量濃度作為儀器檢測(cè)限，計(jì)算得到儀器檢測(cè)限為0.0005μg/mL；以取量2.0g計(jì)，本方法的檢出限為0.0025mg/kg。以10倍信噪比的方法計(jì)算本方法定量限為0.0075mg/kg，其值遠(yuǎn)低于衛(wèi)生部公布的DMF的檢測(cè)方法的檢測(cè)限（25mg/kg）。

2.3.3 實(shí)際樣品分析和回收率實(shí)驗(yàn) 分別在空白樣品中加入不同量的DMF，混勻，按前述方法處理樣品，用GC-MS/MS測(cè)定，分別計(jì)算回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表2可見，方法的回收率為84.7%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%～3.61%。加標(biāo)樣品和面包樣品的二級(jí)總離子流色譜圖分別為圖6和圖7。

表2 DMF加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)（n=3）Table 2 Spike recovery test of DMF（n=3）

圖6 DMF加標(biāo)樣品的二級(jí)總離子流色譜圖（0.05mg/kg）Fig.6 The second step complete total ion chromatogram of DMF add standard sample（0.05mg/kg）

圖7 面包樣品的二級(jí)總離子流色譜圖Fig.7 The second step complete total ion chromatogram of bread

3 結(jié)論

本研究建立的測(cè)定面包和餅干中DMF含量的方法，采用了氣相色譜-三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式，經(jīng)碰撞能量?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定特征離子，獲得了極高的檢測(cè)靈敏度；同時(shí)分析了提取溶劑和超聲波提取時(shí)間對(duì)回收率的影響，最終確定提取溶劑為乙酸乙酯，超聲波提取時(shí)間為25min。經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品分析，相關(guān)線性、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能取得很好的效果。本方法定量限為0.0075mg/kg，遠(yuǎn)低于衛(wèi)生部公布的DMF的檢測(cè)方法的檢測(cè)限（25mg/kg）。因此，本方法具有準(zhǔn)確、回收率高、檢出限低等優(yōu)勢(shì)，在定性和定量分析方面都能滿足面包和餅干中DMF的分析要求。

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