趙志敬，蔣歡，沈文婷，宋瀲滟，胡廣

北大工學(xué)院紹興技術(shù)研究院 生物工程中心，浙江 紹興 312000

谷氨酸棒狀桿菌是非病原性的革蘭氏陽(yáng)性菌，常被用于生產(chǎn)多種氨基酸[1]。經(jīng)多年改造，有望用于大規(guī)模的蛋白生產(chǎn)[2]。以它為表達(dá)宿主有以下優(yōu)勢(shì)：1) 高效的分泌信號(hào)肽及分子伴侶系統(tǒng)使所分泌的重組蛋白大多具有生物活性[3]；2) 除常規(guī)分泌途徑外，還可通過(guò)雙精氨酸易位途徑進(jìn)行分泌[4]；3) 不產(chǎn)生內(nèi)毒素，安全性好；4) 分泌的蛋白酶少，產(chǎn)物穩(wěn)定[3]；5) 人們積累了豐富的發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)，所以這是一種非常優(yōu)良的工程菌株。

CBD是纖維素酶的一個(gè)蛋白域，含若干可吸附至纖維素表面的疏水區(qū)，能提高纖維素酶活[5]。親和標(biāo)簽是純化重組蛋白的常用方法，而 CBD標(biāo)簽較為獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白性能的干擾小，且它的吸附填料——纖維素成本低廉[6]。近年來(lái)已有研究開(kāi)始應(yīng)用CBD為純化標(biāo)簽進(jìn)行蛋白純化[7]。

在谷氨酸棒狀桿菌的表達(dá)系統(tǒng)中，分泌到胞外的蛋白可通過(guò)離心、透析、濃縮或親和層析等方法獲得。但它們所使用的緩沖液及親和樹(shù)脂的高成本會(huì)加大蛋白純化代價(jià)。本研究應(yīng)用 CBD標(biāo)簽優(yōu)化谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)系統(tǒng)的純化工藝，試圖降低生產(chǎn)成本。首先，合成里氏木霉的外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ的 CBD基因并插入至谷氨酸棒狀桿菌分泌表達(dá)載體，獲得以 CBD為純化標(biāo)簽的重組載體；然后，在該載體中插入 GFP基因并轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒狀桿菌進(jìn)行融合蛋白GFP-CBD的表達(dá)；最后，利用 CBD標(biāo)簽對(duì)纖維素柱的可逆性吸附，對(duì)發(fā)酵液中的目的蛋白進(jìn)行純化，實(shí)現(xiàn)蛋白生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和試劑

谷氨酸棒狀桿菌C. glutamicum13032、質(zhì)粒pXMJ19-sp由天津科技大學(xué)的路福平教授提供；質(zhì)粒 pMXS-IRES-GFP為實(shí)驗(yàn)室自有；纖維素填料Avicel PH-102NF購(gòu)自 FMC Biopolymer。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基和MMTG培養(yǎng)基[8]。

1.1.3 序列合成

參考Van等的CBD序列[9]，由公司合成并插入至克隆載體pGS3形成pGS3-CBD，序列如圖1所示：

圖1 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的CBD序列Fig. 1 CBD sequence after code optimization.

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建CBD標(biāo)簽的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體

試驗(yàn)流程如圖2所示：AgeⅠ和PstⅠ雙酶切質(zhì)粒 pGS3-CBD并將目的基因 CBD連接至pXMJ19-sp，構(gòu)建以CBD為純化標(biāo)簽的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體pXMJ19-sp-CBD。

1.2.2 GFP表達(dá)載體的構(gòu)建

帶CBD標(biāo)簽的GFP表達(dá)載體：以pMXS-IRESGFP 為模板，GF (5-CGCTCGAGATGGTGAGCAA GGGCGAGGAG-3)，GR1 (5-AAAAACCGGT CTT GTACAGCTCGTCCATG-3) 為引物，PCR 擴(kuò)增不含終止子的GFP片段，然后用XhoⅠ和AgeⅠ雙酶切連接至表達(dá)載體pXMJ19-sp-CBD形成以CBD為純化標(biāo)簽的GFP表達(dá)載體pXMJ19-sp-GFP-CBD。

帶 polyHis標(biāo)簽的 GFP表達(dá)載體：以pMXS-IRES-GFP為模板，上述GF和GR2 (5-TGA CCTGCAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGCTTGT ACAGCTCGTCCATG-3) 為 引 物 ，PCR 擴(kuò) 增GFP-His片段并用XhoⅠ和PstⅠ雙酶切連接至pXMJ19-sp，構(gòu)建以polyHis為純化標(biāo)簽的GFP表達(dá)載體pXMJ19-sp-GFP-His。

圖2 pXMJ19-sp-CBD的構(gòu)建流程圖Fig. 2 Construction of pXMJ19-sp-CBD.

1.2.3 谷氨酸棒狀桿菌的轉(zhuǎn)化及表達(dá)

參考Van等的方法進(jìn)行質(zhì)粒的谷氨酸棒狀桿菌電轉(zhuǎn)化[10]，并在MMTG培養(yǎng)基中進(jìn)行分泌表達(dá)。

1.2.4 蛋白純化

粗提?。喊l(fā)酵液離心所得上清即為蛋白粗液。

鎳柱純化：30 mL蛋白粗液添加終濃度400 mmol/L NaCl后上樣至經(jīng)磷酸緩沖液預(yù)平衡的0.5 mL鎳柱，以含10、20和250 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液洗脫10、3和5 mL，收集各步驟液體。

纖維素柱純化：在蛋白粗液中添加終濃度1 mol/L的硫酸銨后上樣至預(yù)平衡的0.5 mL纖維素柱，分別用1、0.5和0 mol/L硫酸銨溶液洗脫10、3和5 mL，收集各步驟液體。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBD標(biāo)簽的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體構(gòu)建

將質(zhì)粒 pGS3-CBD的 CBD基因克隆至pXMJ19-sp，如圖 3A所示：雙酶切的鑒定結(jié)果證明已經(jīng)成功獲得以 CBD 為純化標(biāo)簽的pXMJ19-sp-CBD。

2.2 GFP分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

將1.2.2所得GFP-His和GFP基因分別克隆至pXMJ19-sp和pXMJ19-sp-CBD，如圖3B所示：雙酶切的鑒定結(jié)果顯示已成功獲得 GFP的分泌表達(dá)載體pXMJ19-eGFP-His和pXMJ19-eGFP-CBD。

2.3 重組菌的構(gòu)建與表達(dá)

圖3 載體的酶切鑒定Fig. 3 Restriction map of recombinant vector. M: DNA marker; 1: CBD gene; 2: pXMJ19-sp-CBD; 3: pXMJ19-sp-CBD-Age I-Pst I; 4: GFP-His; 5: GFP; 6: pXMJ19-sp; 7:pXMJ19-sp-GFP-His; 8: pXMJ19-sp-GFP-CBD; 9:pXMJ19-sp-His-Xho I; 10: pXMJ19-GFP-CBD-Xho I-Pst I;11: pXMJ19-sp-CBD-Age I-Pst I.

將上述載體分別轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建重組菌C. glutamicum-pXMJ19-sp，C. glutamicum-pXMJ19-sp-GFP-His，C. glutamicumpXMJ19-sp-GFP-CBD。在MMTG培養(yǎng)中誘導(dǎo)表達(dá)3 d后離心，所得上清如圖4B所示：在紫外燈下顯示強(qiáng)烈的綠色熒光。蛋白粗液的SDS-PAGE分析如圖 4C所示：所誘導(dǎo)表達(dá)的 GFP-His和 GFP-CBD約30 kDa，這與理論計(jì)算值 (28 kDa和33 kDa) 一致，經(jīng) BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，可估算該重組蛋白的分泌表達(dá)量約200 mg/mL。

2.4 蛋白純化

蛋白粗液的鎳柱純化結(jié)果如圖4D所示，通過(guò)鎳柱純化可獲得純度達(dá) 90%的目的蛋白，經(jīng) BCA法檢測(cè)可知其濃度為1.48 mg/mL，回收率達(dá)78%，鎳柱對(duì)該蛋白的吸附能力達(dá)8.8 mg/mL；蛋白粗液的纖維素柱純化結(jié)果如圖 4E所示：纖維素柱純化可獲得90%以上純度的目的蛋白，經(jīng)BCA法檢測(cè)可知其濃度為1.40 mg/mL，回收率達(dá)60%，纖維素柱對(duì)該蛋白的最大吸附能力為8.4 mg/mL。

吸附在纖維素柱上的重組蛋白可被純水洗脫，如圖4F所示：肉眼即可觀(guān)察到目的蛋白在柱上的移動(dòng)，而沒(méi)有CBD標(biāo)簽的蛋白則不會(huì)出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象。

圖4 重組蛋白eGFP-His，eGFP-CBD的分泌表達(dá)純化Fig. 4 Secretion and purification of recombinant pXMJ19-GFP-His and pXMJ19-GFP-CBD in C.glutamicum. 1: pXMJ19; 2: pXMJ19-GFP; 3: pXMJ19-GFP-CBD. (A, B) Fermentation broth under white/UV light. (C) SDS-PAGE analysis of secretion protein after dialysis. (D, E) Separation on Ni/cellulose matrices. (F)Separation of protein on a cellulose matrices.

3 討論

由于產(chǎn)內(nèi)毒素和易形成包涵體，大腸桿菌無(wú)法達(dá)到食品級(jí)用酶的生產(chǎn)要求，而谷氨酸棒狀桿菌無(wú)此局限。日本味之素公司新開(kāi)發(fā)的谷氨酸棒桿狀菌表達(dá)系統(tǒng)專(zhuān)門(mén)用于表達(dá)大腸桿菌難以生產(chǎn)的蛋白[11]。劉凱等通過(guò)谷氨酸棒狀桿菌分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，所得培養(yǎng)基具有交聯(lián)酪蛋白活性，說(shuō)明該系統(tǒng)有望實(shí)現(xiàn)食用蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)[12]。

本研究首次以 CBD標(biāo)簽為谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)系統(tǒng)的純化標(biāo)簽，旨在優(yōu)化其生產(chǎn)工藝。參考谷氨酸棒狀桿菌信號(hào)肽篩選的結(jié)果，所選用的信號(hào)肽為 cgR蛋白信號(hào)肽[13]。融合蛋白的分泌量達(dá)200 mg/L，而且有研究表明不同的谷氨酸棒狀桿菌的分泌表達(dá)能力不同。本研究使用的C. glutamicum13032并不是最高效的分泌表達(dá)菌株，例如Corynebacterium callunae15991、13870、CC13826的分泌表達(dá)能力均在其之上，所以選擇合適的菌株將有助于進(jìn)一步提高分泌表達(dá)量[14]。

本研究所分泌表達(dá)的GFP-CBD可在1 mol/L的硫酸銨存在下吸附在纖維素柱上，之后在純水條件下被洗脫，且純化效果與鎳柱純化相當(dāng)。其中分泌到培養(yǎng)基中的GFP-CBD為可溶性蛋白，在紫外燈下顯示綠色熒光，說(shuō)明與CBD融合表達(dá)并沒(méi)有影響GFP的正確折疊。Romas等通過(guò)融合表達(dá)CBD簡(jiǎn)化抗菌肽LL37的純化，所得抗菌肽具抗菌活性，說(shuō)明CBD較為獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白的活性影響較小[15]。

該方法所用填料應(yīng)選擇孔徑較小的微晶纖維素。Naohisa等用的80 μm微晶纖維素，其吸附能力達(dá)15 mg/mL，而本研究的PH-102NF為150 μm的微晶纖維素有8 mg/mL的吸附能力，均比Whatman公司的大孔徑纖維素粉CF1、CC31和CC41 (0.54、0.89和1.4 mg/mL) 要強(qiáng)[16]。但相較于傳統(tǒng)的鎳柱，在性?xún)r(jià)比上已經(jīng)高出很多，且所用緩沖液 (硫酸銨)和洗脫液 (蒸餾水) 相對(duì)便宜，操作簡(jiǎn)便。所以以CBD為純化標(biāo)簽的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)系統(tǒng)既解決原核表達(dá)中內(nèi)毒素問(wèn)題，又降低純化過(guò)程中由于親和樹(shù)脂及緩沖液造成的高成本，為實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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