譚燕，梁惠玉，伍錫棟，高宇博，張興梅

1 南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 神經(jīng)生物學教研室，廣東 廣州 5105152 南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510515

細胞酶聯(lián)反應法 (cell-ELA) 測定特異結合U87-EGFRvⅢ細胞的適配子的親和力

譚燕1，梁惠玉1，伍錫棟1，高宇博2，張興梅1

1 南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 神經(jīng)生物學教研室，廣東 廣州 510515
2 南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510515

譚燕, 梁惠玉, 伍錫棟, 等. 細胞酶聯(lián)反應法 (cell-ELA) 測定特異結合 U87-EGFRvⅢ細胞的適配子的親和力. 生物工程學報, 2013, 29(5): 664?671.

Tan Y, Liang HY, Wu XD, et al. Cell-ELA-based determination of binding affinity of DNA aptamer against U87-EGFRvIII cell. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 664?671.

通過細胞-指數(shù)級富集的配基系統(tǒng)進化 (Cell based systematic evolution of ligands by exponential enrichment，cell-SELEX) 方法從隨機文庫中篩選得到與穩(wěn)定過表達人表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ) 的膠質瘤細胞U87細胞株 (U87-EGFRvⅢ) 特異結合的DNA適配子。以U87-EGFRvⅢ細胞作為檢測對象，篩選到的適配子A15作為檢測分子，建立一種細胞酶聯(lián)反應 (Cell enzyme-linked assay，cell-ELA) 方法測定適配子的親和力，并用EGFR抗體作為對照來比較此種DNA適配子的親和力。結果顯示，所測定的 DNA適配子 A15的解離平衡常數(shù) (Equilibrium dissociation constants，Kd) 小于100 nmol/L，對U87-EGFRvⅢ細胞的結合能力與抗體相似。Cell-ELA法可較方便地用于cell-SELEX中適配子親和力的測定。

細胞酶聯(lián)反應法，細胞-指數(shù)級富集的配基系統(tǒng)進化，DNA適配子，解離平衡常數(shù)

適配子是一類與靶分子特異結合的能形成穩(wěn)定空間結構的寡核苷酸分子。人工篩選得到的適配子有許多優(yōu)于抗體的特點[1-4]：1) 通過各種SELEX技術獲得，方法簡單可行，并能在體外大量合成；2) 與靶分子具有較高的親和力，解離平衡常數(shù)Kd值在pmol/L～nmol/L范圍內；3) 免疫原性低；4) 易合成、保存和修飾，因此可應用于疾病的診斷和治療。經(jīng)過 20余年的研究，SELEX技術得到了改進和發(fā)展。近年來，cell-SELEX技術發(fā)展迅速，用活細胞或者活細胞上的某些生物分子作為靶標，在生理狀態(tài)下篩選到的適配子更有意義，這將為腫瘤細胞表面特異生物標志物的篩選提供平臺。

在 cell-SELEX篩選中需要用合適的方法來鑒定適配子是否富集；富集得到的適配子也需要合適的方法來測定其與細胞的親和力。本研究利用經(jīng)典ELISA的方法和生物素-鏈親和素系統(tǒng)，建立并進行 cell-ELA實驗來定量鑒定適配子與靶細胞的親和力，為 cell-SELEX篩選得到的適配子的親和力檢測提供了一種簡便方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293、U87以及穩(wěn)定過表達 EGFRvⅢ的 U87-EGFRvⅢ細胞株由本實驗室保存，SH-SY5Y細胞株從ATCC (美國模式培養(yǎng)物集存庫) 購買。PCR用的DNATaq酶購自TaKaRa公司；DNA文庫、測序及探針標記引物由Invitrogen公司合成；辣根過氧化物酶標記的鏈親和素 (1∶1 000) 購自Sigma公司，抗EGFR蛋白抗體 (兔多克隆抗體) 購自Santa Cruz公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。酶標儀為 VICTOR?X3 Multilabel Plate Reader，購自 PerkinElmer公司；Mastercycler梯度PCR儀器為Eppendorf公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡型號為Olympus MX7600。細胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司；96孔酶標板購自Costar公司。

1.2 方法

1.2.1 生物素或FITC標記的DNA適配子A15的制備

圖1 適配子A15的篩選過程[7] (DNA文庫與對照細胞 (紅色) 孵育后，將與之不結合的 DNA (灰色) 再與靶細胞 (綠色) 孵育，得到與靶細胞結合的 DNA(黃色)，通過不對稱PCR大量擴增獲得DNA單鏈，即為亞庫，接著進行下一輪篩選)Fig. 1 The procedure of cell-SELEX[7]. In cell-SELEX,a DNA library is first incubated with a non-target cell(shown in red) in a counter-selection step. Non-specific membrane proteins are shown in grey. Unbound aptamers are then recovered and incubated with the target cell (shown in green), which may express either a particular target (specific target membrane proteins shown in color) or target cell type. Bound aptamers(yellow) are recovered by phenol extraction and amplified via asymmetrical PCR.

通過cell-SELEX的方法 (圖1) 從隨機DNA文庫中篩選到能與 U87-EGFRvⅢ細胞特異結合的DNA適配子A15，其中篩選過程中引入負篩細胞 U87 (EGFRvⅢ表達陰性) 細胞作為對照，以去除細胞表面相同蛋白分子的干擾。相應的DNA文庫序列為5'-GCAATGGTACGGTACTTCC(30N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'[5]。得到的 A15適配子通過不對稱 PCR法[6]用相應的標記引物擴增并切膠回收，通過乙醇沉淀法得到DNA單鏈。

1.2.2 A15特異識別U87-EGFRvⅢ細胞

HEK293、SH-SY5Y、U87和U87-EGFRvⅢ細胞在 48孔板中培養(yǎng)過夜，用洗滌緩沖液(0.45%葡萄糖-5 mmol/L氯化鎂-PBS) 漂洗一次。將 200 pmol的 FITC標記的 A15加入到500 μL結合緩沖液 (0.01% BSA-0.45%葡萄糖-5 mmol/L氯化鎂-PBS)，95 ℃加熱 5 min，冰上放置10 min后加入培養(yǎng)板中。放置在5% CO2、37 ℃孵箱中孵育1 h，每隔5 min振搖一次。孵育完畢，用洗滌緩沖液洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min后用PBS洗滌3次，然后用1 mg/mL DAPI (1∶1 000) 染色10 min，在熒光顯微鏡下觀察 (40倍物鏡)。整個實驗過程避光操作。

1.2.3 細胞酶聯(lián)反應法 (cell-ELA) 檢測A15對U87-EGFRvⅢ細胞的親和力

在 96孔板中接種密度為 1×105個/mL的U87-EGFRvⅢ細胞，在37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h后用0.1 mol/L PBS (pH 7.2～7.4) 漂洗一次，再用4%的多聚甲醛固定15 min。用1×PBST(0.01%的Tween-20) 洗板3次，5% BSA于37 ℃封閉2 h后棄封閉液，洗板3次。用PBS (加入0.01% 鮭魚精DNA) 對生物素標記的初始DNA文庫、A15進行倍比稀釋，樣品終濃度分別為：2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/L，各樣品在95 ℃處理5 min，立刻置于冰上10 min后加入至U87-EGFRvⅢ細胞的培養(yǎng)孔中37 ℃孵育1 h，1×PBST洗板3次。每孔加入 50 μL辣根過氧化物酶標記的鏈親和素-PBS溶液 (1∶1 000)，37 ℃孵育30 min后洗滌3次，每孔加入50 μL TMB顯色液，37 ℃避光顯色10 min。最后每孔加50 μL 2 mol/L硫酸終止反應，在酶標儀上測定450 nm的吸光度值。用SigmaPlot 12.0軟件處理數(shù)據(jù)，擬合曲線方程Y=BmaxX/Kd+X，求出Kd值。用抗EGFR的抗體代替生物素標記的A15加入至U87-EGFRvⅢ細胞中，用 5% BSA作為緩沖液倍比稀釋抗體，樣品終濃度為：4 ng/μL (27.59 nmol/L)，2 ng/μL(13.79 nmol/L)，1 ng/μL (6.90 nmol/L)，0.5 ng/μL(3.45 nmol/L)， 0.25 ng/μL (1.72 nmol/L)，0.125 ng/μL (0.86 nmol/L) ， 0.0625 ng/μL(0.43 nmol/L)，0.03125 ng/μL (0.21 nmol/L)，羊抗兔HRP標記二抗1∶5 000稀釋，檢測方法同上。實驗設置空白 (不加一抗) 對照。陰性對照為生物素標記的初始DNA文庫。

1.2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析

用SigmaPlot 12.0軟件中非線性回歸分析作圖，求出曲線方程，比較方程中參數(shù)。

2 結果

2.1 生物素或FITC標記的適配子A15的制備

以A15的菌液為模板進行不對稱PCR擴增，其中上游引物帶有生物素標記，擴增的兩條鏈的比例為1∶4，擴增較多的短鏈即為標記上生物素或FITC的單鏈，大量切膠回收純化后，用7 mol/L尿素-8%聚丙烯酰胺變性膠電泳鑒定 (圖2)。結果表明通過不對稱PCR法獲得了生物素或FITC標記的DNA適配子。

2.2 A15特異識別U87-EGFRvⅢ細胞

通過Western blotting實驗用EGFR抗體對U87和 U87-EGFRvⅢ兩種細胞進行鑒定。結果顯示 U87細胞表達 EGFR (170 kDa)，而U87-EGFRvⅢ過表達 EGFRvⅢ，它是 EGFR缺失了胞外區(qū)2～7個外顯子的的Ⅲ型突變體，條帶分子量為 145 kDa (圖 3)。FITC-A15分別與HEK293、SH-SY5Y、U87和U87-EGFRvⅢ細胞孵育，用熒光顯微鏡觀察結合特異性情況，結果見圖 4。未加 FITC-A15的細胞未觀察到熒光，即為細胞背景，加入了 FITC-A15后，在U87-EGFRvⅢ細胞上可觀察到綠色熒光，HEK293、SH-SY5Y和 U87細胞都觀察不到明顯的熒光，DAPI染色后，細胞核呈藍色。結果表明，A15能特異識別U87-EGFRvⅢ細胞。

圖2 不對稱PCR切膠回收得到的biotin和FITC標記的適配子A15Fig. 2 Biotinylated and FITC-labeled A15 aptamers were generated by asymmetrical PCR. 1: pUC18 DNA/Msp l; 2: biotin-A15; 3: FITC-A15.

圖3 EGFR抗體鑒定U87和U87-EGFRvⅢ細胞的免疫印跡實驗Fig. 3 U87 and U87-EGFRvIII cells identified by Western blotting. 1: U87 cells expressing EGFR(170 kDa); 2: U87-EGFRvIII cells overexpressing EGFRvIII (145 kDa).

圖 4 熒光顯微鏡檢測適配子 FITC-A15對U87-EGFRvⅢ的特異性結合 (40×)Fig. 4 Fluorescent microscope imaging of U87-EGFRvIII, U87, and HEK293 cells stained with FITC-A15. U87 and HEK293 cells served as negative controls (40×).

2.3 Cell-ELA檢測初始DNA文庫、A15適配子和EGFR抗體三者對U87-EGFRvIII細胞的親和力

用cell-ELA方法檢測生物素標記的初始DNA文庫、A15和抗 EGFR的抗體對 U87-EGFRvⅢ細胞的親和力，測定450 nm時的吸光度值，在Sigmaplot 12.0軟件中進行非線性回歸分析，擬合曲線見圖 5。分析結果發(fā)現(xiàn) A15的 Kd值為(14.09±2.95) nmol/L (R=0.9653)，小于 100 nmol/L，與以往報道過的 cell-SELEX篩選到的適配子親和力在pmol/L～nmol/L范圍內相符。適配子A15的Kd值與抗體EGFR對U87-EGFRvⅢ細胞的親和力 (Kd=0.32±0.01 nmol/L，R=0.9989) 相比，A15的親和力已經(jīng)接近抗體的親和力。陰性對照初始DNA文庫的Kd值為 (726.28±200.75) nmol/L(R=0.9952)，由此可見，相比初始DNA文庫而言，A15和 EGFR抗體對U87-EGFRvⅢ細胞有較高的親和力。

圖5 Cell-ELA法測定初始DNA文庫、適配子A15或抗體EGFR對U87-EGFRvⅢ細胞的親和力Fig. 5 The binding affinity of the initial library,aptamer A15 and an anti-EGFR antibody for U87-EGFRvIII cells as measured by cell-ELA.

3 討論

目前在 cell-SELEX技術應用中，測定適配子 Kd值的方法有流式細胞技術[8](Flow cytometry，F(xiàn)CM)、熒光定量分析[9](Fluorescence quantification analysis，F(xiàn)QA)、放射免疫法[10](Radioimmunoassay，RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等。其中ELISA試驗用于cell-SELEX中適配子與靶分子親和力的測定具有如下優(yōu)點：生物素標記的適配子比熒光標記的要穩(wěn)定；整個 ELISA試驗操作簡便經(jīng)濟；所用試劑成本低且無污染；測定的結果靈敏度高。ELISA在適配子的親和力的測定已經(jīng)有了很多應用，早在 2004年已有研究小組建立了酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗(Enzyme-1inked oligonucleotide assay，ELONA)方法用于hTNF-α的檢測[11]。CHO等[12]用ELISA方法來檢測針對SARS COV (冠狀病毒) N蛋白的DNA適配子是否富集及其親和力，得到適配子 1 (Kd=4.93±0.30 nmol/L) 和適配子 11(Kd=9.02±1.89 nmol/L)。Kazem 等[13]在 4 ℃條件下用 ELISA方法測定不同篩選輪數(shù) DNA 適配子對HER2高表達細胞及對照細胞的結合力，隨著篩選輪數(shù)的增加，吸收值也增加，表明適配子在富集。Zhu等[14]篩選針對MPT64抗體的DNA適配子，并嘗試用 ELISA方法來檢測臨床血清樣本，數(shù)據(jù)證明其最低檢測限為0.2 mg/L，是用于肺結核病人血清診斷的一種有效的方法。

EGFRvⅢ是 EGFR胞外區(qū) 2～7個外顯子(EGFR?2-7) 缺失導致的突變體，與腫瘤的侵襲性和致瘤性有關[15-16]。EGFRvⅢ在正常細胞中不表達[17-21]，在 25%的惡性膠質瘤中過表達[22]，因此篩選特異識別 EGFRvⅢ的適配子對探求診斷和治療惡性膠質瘤的方法具有重大意義。

本研究在 Friguet法[23]基礎上，通過以全細胞表面分子作為抗原，生物素標記的適配子作為抗體，利用生物素-鏈親合素系統(tǒng)應用于 ELISA試驗[24]來測定適配子 A15與 U87-EGFRvⅢ的Kd值。結果顯示與抗體相比，適配子的親和力接近抗體的親和力。熒光顯微鏡觀察也證實適配子對靶細胞具有特異識別能力。目前熒光定量分析方法檢測適配子對靶細胞的親和力，標記探針用的熒光染料有異硫氰酸熒光素 (FITC)、羥基熒光素 (FAM)、四氯熒光素 (TET) 等，但此類熒光素類衍生物有共同的缺點：光淬滅率高、pH敏感性強和發(fā)射波譜寬等[25-27]。Cell-ELA法克服了熒光標記方法進行定量分析的缺點，實現(xiàn)非熒光標記定量檢測微量物質的目的，解決了篩選中適配子親和力的定量分析問題，為建立cell-SELEX篩選技術平臺提供了重要保證。但以細胞作為抗原進行 cell-ELA有諸多的缺點，比如：空白值與單純的純化蛋白相比要高；由于細胞的貼壁特性，不能使用雙抗夾心法[11]等更加靈敏的 ELISA方法用來測定適配子與靶分子的親和力。

Cell-ELA可以代替熒光標記法進行定量分析，進一步證明了ELISA在cell-SELEX中測定適配子親和力的應用可行性；適配子和單克隆抗體一樣，可以作為檢測分子用于診斷某些疾病。

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November 13, 2012; Accepted: February 1, 2013

Xingmei Zhang. Tel: +86-20-61648215; E-mail: zhangxm@smu.edu.cn

Cell-ELA-based determination of binding affinity of DNA aptamer against U87-EGFRvIII cell

Yan Tan1, Huiyu Liang1, Xidong Wu1, Yubo Gao2, and Xingmei Zhang1
1Department of Neurobiology,School of Basic Medical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou510515,Guangdong,China
2First Clinical Medicine College,Southern Medical University,Guangzhou510515,Guangdong,China

A15, a DNA aptamer with binding specificity for U87 glioma cells stably overexpressing the epidermal growth factor receptor variant III (U87-EGFRvIII), was generated by cell systematic evolution of ligands by exponential enrichment (cell-SELEX) using a random nucleotide library. Subsequently, we established a cell enzyme-linked assay(cell-ELA) to detect the affinity of A15 compared to an EGFR antibody. We used A15 as a detection probe and cultured U87-EGFRvIII cells as targets. Our data indicate that the equilibrium dissociation constants (Kd) for A15 were below 100 nmol/L and had similar affinity compared to an EGFR antibody for U87-EGFRvIII. We demonstrated that the cell-ELA was a useful method to determine the equilibrium dissociation constants (Kd) of aptamers generated by cell-SELEX.

cell enzyme-linked assay (cell-ELA), cell based systematic evolution of ligands by exponential enrichment(cell-SELEX), DNA aptamer, Kd

book=670,ebook=397

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81272509, 30973481).

國家自然科學基金 (Nos. 81272509，30973481) 資助。

(本文責編 郝麗芳)