張捷，許美玲，王璇，王煜，王小晉，劉巖，顧德周，陳廣全，王佩榮，樂加昌

1 北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026

2 臨沂出入境檢驗檢疫局，山東 臨沂 276034

3 中國科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101

4 中國合格評是國家認可中心，北京 100062

5淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇 淮安 223001

6 中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院檢驗科，北京 100102

輪狀病毒 (Rotavirus，RV) 是全世界范圍內(nèi)人和動物急性腹瀉的主要致病微生物之一，是引起嬰幼兒急性腸胃炎的主要原因[1-2]。近年的研究資料表明，我國秋冬季節(jié)50%～60%的嬰幼兒腹瀉是由輪狀病毒引起的，輪狀病毒感染已經(jīng)成為威脅公共衛(wèi)生安全的重要因素之一[3-4]。輪狀病毒主要通過糞-口途徑傳播，對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。因此，建立食源性輪狀病毒的快速檢測方法，對保障食品安全和人類健康非常重要。

輪狀病毒為呼腸病毒科輪狀病毒屬病毒，由11個基因組片段組成。內(nèi)殼具有 4個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和VP6)，外殼具有2個結(jié)構(gòu)蛋白 (VP4和VP7)。其中VP4和 VP7是 2個主要的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，它們決定了輪狀病毒的血清型和病毒中和作用。根據(jù)VP4和VP7基因抗原性的差異，將輪狀病毒分為不同的血清型，分別為P和G血清型[5-7]。

檢測輪狀病毒的方法主要有電鏡技術(shù)、分離培養(yǎng)、免疫檢測技術(shù)和基因檢測技術(shù)等方法[8-12]。但是電鏡技術(shù)的主要缺點在于它要求每毫升樣本中包含約106個病毒顆粒。而且病毒顆粒易于降解，常常對其正確診斷產(chǎn)生影響。分離培養(yǎng)檢測技術(shù)的檢測靈敏度較低，需要特殊的培養(yǎng)條件，所以對于輪狀病毒的基礎(chǔ)研究和臨床診斷有限。以抗原檢測為基礎(chǔ)的檢測方法的缺點是特異性和靈敏度相對較低，而且不能有效地進行定量檢測?；驒z測技術(shù)特異性和靈敏度較好，但是需要較長時間和專業(yè)技術(shù)人員操作，不利于臨床快速檢測。

分子馬達生物傳感技術(shù)是近年發(fā)展起來的新興技術(shù)，具有直觀、敏感性高、速度快、操作簡便和污染少等優(yōu)點。ATP合酶 (F0F1-ATPase)是一個旋轉(zhuǎn)的生物分子馬達，負責生物體內(nèi)的能量轉(zhuǎn)化。F0F1-ATPase既能利用跨膜質(zhì)子梯度合成 ATP，又能水解 ATP而轉(zhuǎn)運質(zhì)子。若能在細胞外實現(xiàn)由化學(xué)能到機械能的轉(zhuǎn)化，將分子馬達設(shè)計成一個納米裝置，實現(xiàn)對病原微生物快速檢測，這將搭建一個檢測病原微生物的新平臺。通過構(gòu)建基于F0F1-ATPase的旋轉(zhuǎn)生物傳感器，已經(jīng)在一些病毒如禽流感病毒、鼠肝炎病毒、小分子鹽酸克倫特羅、沙門氏菌、霍亂弧菌檢測等方面取得許多成果[13-17]。但是在食源性病毒檢測方面尚屬空白，因此，我們進一步研究了基于載色體內(nèi)F0F1-ATPase的分子馬達技術(shù)來檢測輪狀病毒。為了提高對食源性輪狀病毒的檢測水平，加強對輪狀病毒疫情的預(yù)防和控制，本實驗室建立了輪狀病毒F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及樣品

凍干型甲型肝炎減毒活疫苗來源于浙江普康生物技術(shù)股份有限公司；諾如病毒和輪狀病毒由中國疾病預(yù)防控制中心病毒所提供。樣品來自于日常檢測所留存的樣品。

1.1.2 儀器

超速冷凍離心機 CP100MX、F4500熒光光譜儀購自日本 HITACHI公司；恒溫搖床購自江蘇太倉實驗儀器設(shè)備廠；超純水儀購自美國Thermo公司；化學(xué)發(fā)光檢測儀購自美國Promega公司；高壓滅菌鍋購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PCR儀PTC-200購自美國伯樂公司；凝膠成像系統(tǒng)BIO-PRINT購自法國VILBER公司。

1.1.3 主要試劑

生物素 (Biotin-AC5-Sulfo-Osu) 購自日本Dojindo公司；鏈球菌抗生物蛋白 (Streptavidin)、二磷酸腺苷 (ADP) 購自美國 Sigma公司；F-DHPE熒光探針購自美國 Invitrogen公司；熒光素酶購自美國 Promega公司；QIAGEN病毒 RNA提取試劑盒：購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

使用QIAGEN公司病毒RNA提取試劑盒提取待測物病毒 RNA，詳細操作步驟見試劑盒說明書。獲得的病毒 RNA用作分子馬達傳感器的目標檢測物。提取后的基因組用分光光度計確定所提取基因組RNA溶液的濃度和純度。該RNA提取液置于冰箱中?20 ℃保存，使用時置于室溫自然解凍，用振蕩器振蕩混勻。

1.2.2 探針合成及標記

以輪狀病毒 VP7基因的高度保守區(qū)段設(shè)計探針，探針序列為5-AAGCGGATTATGCAGAA GCACTG-3。探針合成及探針5端生物素標記由大連寶生物公司完成。

1.2.3 載色體 (Chromatophore) 的制備

載色體的制備參照 Suzuki等[18]及 Cui等[19]的方法進行。將玫瑰嗜熱菌Thermomicrobiumroseum菌種按比例1∶100接種到液體培養(yǎng)基，60 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng) 24 h。然后 4 ℃、4 000 r/min離心30 min收集菌體。用提取緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，pH 8.0) 重懸菌體。4 ℃、6 000 r/min離心10 min去上清。加入提取緩沖液重懸菌體 (10 mL緩沖液/g)，再加入PMSF至終濃度1 mmol/L，置于冰上超聲破碎30 min (超聲5 s，停8 s)。將破碎菌體于4 ℃、25 000 r/min離心30 min，取上清于一新的離心管中，4 ℃、145 000 r/min超速離心1 h，取沉淀即為載色體。最后用提取緩沖液重懸沉淀并加入終濃度 50%的甘油，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 F-DHPE標記載色體

按照Su等[20]的方法用F-DHPE標記載色體。取 200 μL載色體于一離心管中，加入 10 μL F-DHPE (200 mg/mL，溶于乙醇)，混勻，室溫避光輕微振蕩孵育15 min。加入PBS (10 mmol/L，pH 7.4) 至總體積1.3 mL后，于4 ℃、30 000 r/min離心 15 min，去上清，沉淀用 PBS在 4 ℃、10 000 r/min離心15 min條件下清洗3次，以除去游離的F-DHPE。最后沉淀用200 μL PBS懸浮，備用。

1.2.5 生物素標記ε亞基抗體

將 2 μL 2 μmol/L 的生物素 (biotin-AC5-Sulfo-Os) 加入到 20 μL ε亞基抗體中，室溫孵育30 min，抗體N端即被標記。

1.2.6 F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器的構(gòu)建

吸取 200 μL F-DHPE標記的載色體于離心管中，加入40 μg N-生物素標記ε亞基抗體，用PBS補加至1 mL，37 ℃孵育1 h；用PBS補加至1.4 mL，4 ℃、30 000 r/min超速離心10 min；棄上清，沉淀用500 μL PBS重懸；加入Avidin(2 mg/mL) 2 μL，用PBS補加至1 mL，室溫，50～100 r/min搖床振蕩反應(yīng)10 min；用PBS補加至1.4 mL，4 ℃、30 000 r/min超速離心10 min，棄上清，沉淀用500 μL PBS重懸；最后，每管各加入 N-生物素標記核酸探針 (2 μmol/L) 2 μL，用PBS補加至1 mL，室溫，50～100 r/min振蕩反應(yīng)10 min；每管用PBS補加至1.4 mL，4 ℃、30 000 r/min超速離心 10 min，棄上清，用 150 μL含 30%甘油的 PBS重懸載色體，放入?20 ℃冰箱備用。所構(gòu)建的分子馬達生物傳感器命名為chro RV。

1.2.7 分子馬達檢測方法的構(gòu)建

基本步驟：取1.5 mL EP管，加入待測樣本10 μL。取 2 μL chro RV，用合成緩沖液稀釋到一定的倍數(shù)。取10 μL稀釋后的chro RV加入上述EP管。另取1個EP管加入10 μL無菌水，再加入10 μL合成緩沖液作為本底對照，短暫振蕩使反應(yīng)體系混勻。再向2個EP管中分別加入30 μL啟動緩沖液 (啟動緩沖液由ADP (1.6 mol/L) 和合成緩沖液按體積比 1∶3配制，每次實驗按需要取一定的量配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)，振蕩使反應(yīng)體系混勻，然后立即短暫離心以除去管蓋內(nèi)壁上的水珠。將上述反應(yīng)體系置于室溫中溫育10 min。將EP管從搖床中取出，分別加入200 μL PBS緩沖液，振蕩使體系混勻。取一塊干凈的96孔板，將2管中的最終反應(yīng)體系加入其中，每個體系加3孔，每孔加樣50 μL。將96孔板上機檢測，處理數(shù)據(jù)，對各組數(shù)據(jù)取平均值，然后用樣本數(shù)值減去本底數(shù)值即為樣本的實際熒光值。百分熒光差值計算公式見公式 (1)。將樣本熒光值絕對值與H2O的陰性對照熒光值絕對值進行單因素方差分析，若差異顯著 (P＜0.05) 表示檢出該病毒。

式中，B表示樣本熒光值；B0表示本底的熒光值；BH2O表示H2O的熒光值。

反應(yīng)條件的優(yōu)化：經(jīng)過試驗摸索，輪狀病毒RNA濃度1 ng/mL，chro RV進行10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍稀釋，測定反應(yīng)的百分熒光差值，百分熒光差值最大即為方法的最佳chro RV濃度；在最佳chro RV濃度下，輪狀病毒RNA分別稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 ng/mL，反應(yīng)的百分熒光差值最大即為最佳輪狀病毒RNA檢測濃度。

特異性試驗：為了檢驗所建立方法的特異性，分別提取輪狀病毒、甲肝病毒、諾如病毒RNA，進行分子馬達檢測。

靈敏度試驗：輪狀病毒 RNA分別稀釋至0.001、0.005、0.01、0.1、1、10、100 ng/mL，以無菌水為陰性對照，在最佳檢測條件下讀取熒光值，與陰性對照差異顯著即為最低檢測濃度。

1.2.8 樣本的檢測及與分子馬達檢測結(jié)果的比較

樣品處理：將日常檢測留存15份經(jīng)RT-PCR檢測已知陰性/陽性貝類樣品，提取RNA進行分子馬達檢測，讀取熒光值，判斷是否檢出輪狀病毒，檢測結(jié)果與RT-PCR方法[21]作比較。

2 結(jié)果

2.1 F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器的構(gòu)建

F-DHPE是一種脂染料探針，可以嵌入到磷脂分子層中。同時F-DHPE也是一種pH指示劑，將其嵌入磷脂雙分子層可以用來測量磷脂層外面的 pH變化。在 pH 7.0～9.0范圍內(nèi)，F(xiàn)-DHPE的熒光強度與 pH值呈正相關(guān)[19]。本研究將F-DHPE標記到分子馬達載色體磷脂分子層中用以指示F0F1-ATPase合成ATP的效率。

F0F1-ATPase (E. coli) 由8個亞基組成，分別為 α3β3γδεab2cn，是一種可旋轉(zhuǎn)分子馬達。ATP的合成與水解發(fā)生在β亞基的3個催化位點上，而質(zhì)子流動則發(fā)生在F0部分的a亞基和c亞基之間。在ATP合成過程中，質(zhì)子由載色體內(nèi)泵出，載色體外H+濃度增大，從而導(dǎo)致載色體外pH值降低，F(xiàn)-DHPE熒光值隨之降低。因此通過檢測F-DHPE熒光值即可判斷ATP合成情況。本研究通過“ε亞基抗體-鏈霉素-生物素-探針”系統(tǒng)連接 F0F1-ATPase構(gòu)建 F0F1-ATPase生物傳感器，結(jié)構(gòu)示意圖見圖1[16]。當傳感器捕獲到目標分子時，F(xiàn)0F1-ATPase由于負載導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)速度下降，ATP合成速度下降，因此質(zhì)子由載色體泵出速度下降，導(dǎo)致載色體外pH值下降速度較空載時慢，對應(yīng)熒光強度下降速度也比空載時慢，因此相比空載，捕獲目標分子的熒光強度相對較高。

圖1 分子馬達傳感器模式圖Fig. 1 Schematic diagram of the F0F1-ATPase molecular motor biosensor. 1: ε-subunit antibody; 2: strptavidin; 3:N-biotin; 4: probe; 5: single strand target RNA.

2.2 分子馬達生物傳感器反應(yīng)體系的建立

2.2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

不同chro RV濃度條件下，H2O、輪狀病毒檢測熒光值及百分熒光差值見表1。從表1可以看出，chro RV稀釋倍數(shù)越小，最終體系的熒光值強度越大，原因是chro RV濃度越高，體系中ATPase也就越多，作用于它的熒光物質(zhì)也就越多，最終熒光值也越大。chro RV在80倍稀釋下差值百分比最大，檢測結(jié)果較為理想，原因為目標物與ATPase上的ε亞基結(jié)合后，ε亞基轉(zhuǎn)速變慢，ATPase的合成速率下降，對反應(yīng)體系起到抑制作用，使得最終的熒光值降低；而 H2O作為陰性對照，最終反應(yīng)體系的熒光值比目標檢測物的熒光值要低，符合理論檢測效果。所以我們選定chro RV在80倍稀釋下的濃度作為檢測濃度。

由圖2可以看出，不同輪狀病毒RNA稀釋濃度的熒光值均顯著高于陰性對照 (P＜0.05)，輪狀病毒RNA濃度為0.6 ng/mL，反應(yīng)體系的熒光值最大，百分熒光差值最大，檢測效果最佳。因此，所建立的生物傳感器對輪狀病毒 RNA最佳檢測濃度是0.6 ng/mL。

2.2.2 特異性試驗

所建立的分子馬達生物傳感器檢測體系與甲肝病毒 (HAV)、諾如病毒 (NV)、H2O沒有交叉反應(yīng) (圖3)，生物傳感器對輪狀病毒的熒光值明顯高于對H2O的熒光值，有顯著差異 (P＜0.05)，而甲肝病毒和諾如病毒的熒光值遠低于RV的熒光值，甲肝病毒、諾如病毒和H2O熒光值無顯著差異 (P＞0.05)。這表明“ε亞基抗體-鏈霉素-生物素-探針”系統(tǒng)連接F0F1-ATPase上，所構(gòu)建的F0F1-ATPase生物傳感器對輪狀病毒檢測特異性良好。重復(fù)此實驗，均能得到相似結(jié)果，方法具有良好的重復(fù)性。

表1 chro RV不同稀釋倍數(shù)下H2O、輪狀病毒RNA的熒光值Table 1 Fluorescence values of H2O and RV RNA under different concentrations of chro RV

圖2 H2O和不同濃度輪狀病毒RNA的熒光值 (*P＜0.05)Fig. 2 Fluorescence values of H2O and different concentrations of RV RNA. *P<0.05.

圖3 chro RV對輪狀病毒 RNA檢測的特異性(*P＜0.05)Fig. 3 Detection specificities of chro RV for RV RNA.Fluorescence values of samples are significant difference compared with H2O (*P<0.05).

2.2.3 靈敏度試驗

輪狀病毒 RNA濃度為0.001 ng/mL時，其熒光值與陰性對照相比無顯著差異 (P＞0.05)(圖4)，不能檢測出輪狀病毒。輪狀病毒RNA濃度在0.005～100 ng/mL時，其熒光值顯著高于陰性對照的熒光值 (P＜0.05)，能夠檢測輪狀病毒。因此，所構(gòu)建的生物傳感器對輪狀病毒 RNA的檢測靈敏度為0.005 ng/mL。

2.3 分子馬達生物傳感器對貝類樣品的檢測

通過對樣品檢測熒光值 (圖5) 發(fā)現(xiàn)，4號樣品和5號樣品與H2O熒光值差值較小，沒有顯著差異 (P＞0.05)，而其余樣品熒光值與H2O相比較差異顯著 (P＜0.05)，因此，可以判斷 4號樣品和5號樣品未檢出輪狀病毒，而其余樣品檢出輪狀病毒。與RT-PCR結(jié)果相比較 (表2)，檢測結(jié)果為：所采用的RT-PCR方法的檢測限核酸水平為 10 pg左右，本方法的檢測限為輪狀病毒RNA濃度0.005 ng/mL，本實驗室所建立的分子馬達生物傳感器對輪狀病毒檢測方法與 RT-PCR檢測方法檢測結(jié)果完全一致，說明所建立的檢測體系準確可靠。

圖4 chro RV對輪狀病毒RNA檢測靈敏度 (*表示樣本熒光值與H2O對照相比較差異顯著，P＜0.05)Fig. 4 Detection sensitivities of chro RV for RV RNA. *Fluorescence values of samples are significant difference compared with H2O (P<0.05).

圖5 15份樣品檢測的熒光值 (*表示樣本熒光值與H2O對照相比較差異顯著，P＜0.05)Fig. 5 Fluorescence values of 15 samples. * Fluorescence values of samples are significant difference compared with H2O (P<0.05).

表2 不同檢測方法檢測結(jié)果 (+表示檢出；?表示未檢出)Table 2 Results of different detect method (+: detected; ?: not detected)

3 討論

近年來，輪狀病毒感染日益成為一個全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題。受污染的食品是輪狀病毒重要傳染源之一。因此，建立食源性輪狀病毒靈敏快速的檢測方法，對于保障人類健康和預(yù)防疫情爆發(fā)具有重要意義。本實驗室采用以嗜熱菌中提取的載色體為材料，構(gòu)建生物傳感器，并將其應(yīng)用于食源性輪狀病毒的檢測。

ATP合酶 (F0F1-ATPase) 又稱H+-ATP酶或F0F1-ATP酶，是負責細胞內(nèi)ATP合成的關(guān)鍵酶，廣泛地存在于動物和真菌的線粒體內(nèi)膜、植物葉綠體類囊體膜及細菌質(zhì)膜中。它既能利用跨膜質(zhì)子梯度合成 ATP，又能水解 ATP同時反向轉(zhuǎn)運質(zhì)子。利用F0F1-ATPase的質(zhì)子轉(zhuǎn)運和旋轉(zhuǎn)特性，本實驗室研制了基于F0F1-ATPase的納米旋轉(zhuǎn)式生物傳感器，它屬于一種光學(xué)生物傳感器，根據(jù)納米生物及其旋轉(zhuǎn)的特性，將探針連接到分子馬達上，旋轉(zhuǎn)的馬達在溶液體系中運動，利用化學(xué)發(fā)光檢測法通過檢測產(chǎn)生 ATP量的差別來達到檢測的目的，具有成本低、靈敏度高、檢測時間短、容易構(gòu)建和操作方便等優(yōu)點。

通過生物素-親和素系統(tǒng)將輪狀病毒特異性分子探針連接在F0F1-ATPase的ε亞基上構(gòu)建生物傳感器，并對檢測體系做了進一步的優(yōu)化。選取輪狀病毒高度保守的 VP7片段設(shè)計輪狀病毒各型通用探針，實現(xiàn)對輪狀病毒的快速檢測。本實驗室所建立的方法對輪狀病毒 RNA檢測靈敏度達到 0.005 ng/mL，且不需酶切及電泳等繁瑣操作，檢測時間縮短到1 h內(nèi)。特異性實驗表明，該方法對輪狀病毒檢測特異，與甲肝病毒、諾如病毒無交叉反應(yīng)。通過對 15份樣品的檢測，其檢測結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果一致，說明所構(gòu)建的分子馬達生物傳感器適用于輪狀病毒的檢測。分子馬達生物傳感器檢測裝置可大量預(yù)制備多次使用，成本較低。因此，本實驗室所建立的方法具有靈敏、快速、特異、經(jīng)濟的優(yōu)點，可用于輪狀病毒臨床診斷、食物中毒的預(yù)警和溯源及食品中輪狀病毒快速檢測。

但仍然存在的問題是本試驗參與反應(yīng)的試劑和樣本都是在液相體系中進行，所以當樣品不純或含有其他雜質(zhì)時，會影響結(jié)果的判定。因此，還可將分子馬達生物傳感器固定在膜上，當樣本流過此膜時，目標物就會與傳感器結(jié)合而固定在膜上，其他雜質(zhì)則不與膜結(jié)合而被洗脫掉，減少了干擾[13]。目前，本研究只做了食源性輪狀病毒的檢測，而常見的食源性病毒除了輪狀病毒外，還包括諾如病毒、甲肝病毒、腺病毒等，因此以本研究為基礎(chǔ)，應(yīng)擴大檢測范圍，利用分子馬達生物傳感器實現(xiàn)對多種食源性病毒的同時檢測。

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