姜文婧，張水軍，嚴(yán)景華，郭寧

1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 2300362 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101

人CD96第一個IgV結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、結(jié)晶及晶體學(xué)分析

姜文婧1,2，張水軍2，嚴(yán)景華2，郭寧1

1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036
2 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101

姜文婧, 張水軍, 嚴(yán)景華, 等. 人CD96第一個IgV結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、結(jié)晶及晶體學(xué)分析. 生物工程學(xué)報, 2013, 29(5): 657?663.

Jiang WJ, Zhang SJ, Yan JH, et al. Expression, crystallization and crystallographic study of the 1stIgV domain of human CD96. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 657?663.

CD96 (Tactile) 是一個主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞上的免疫受體分子。它屬于免疫球蛋白超家族，胞外區(qū)有3個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 (V1，V2/C和C)。最近的研究表明，CD96的第一個IgV結(jié)構(gòu)域 (CD96V1)在細(xì)胞粘附和 NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷過程中起著重要的作用。文中構(gòu)建了人類 CD96第一個 IgV樣結(jié)構(gòu)域(hCD96V1) 的表達(dá)載體，并將它在大腸桿菌 BL21 (DE3) 菌株中以包涵體形式表達(dá)。通過包涵體體外復(fù)性，得到了CD96可溶性蛋白。分析超速離心結(jié)果證明CD96可溶蛋白在體外以二聚體形式存在。采用座滴氣相擴(kuò)散法獲得了衍射質(zhì)量較好的CD96蛋白晶體，衍射分辨率為1.9?，晶體屬于空間群P21，晶胞參數(shù)為a=35.1，B=69.5，C=49.6?，α=γ=90°，β=105.4°。CD96晶體及衍射數(shù)據(jù)的獲得為后續(xù)的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

CD96，第一IgV結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞粘附分子，蛋白純化，結(jié)晶

NK細(xì)胞是天然免疫 (Innnate immunity) 中一類十分重要的淋巴細(xì)胞[1-2]，在抗腫瘤和抗病毒免疫反應(yīng)中起著重要的作用[3-4]。NK細(xì)胞上表達(dá)一類受體分子，可以識別靶細(xì)胞上表達(dá)的Nectins/Necls (Nectin like molecules) 家族分子[5]。這類受體包括CRTAM、CD96、CD226、tigit等。Nectin/Necls家族共有9個分子，分別是Nectin 1、Nectin 2、Nectin 3、Nectin 4、Necl 1、Necl 2、Necl 3、Necl 4及Necl 5[6]。這類受體與配體的相互作用介導(dǎo)NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的粘附，促進(jìn)或者抑制NK細(xì)胞的激活[6-8]。CD96屬于免疫球蛋白超家族，最初被確定為一個新的人類T細(xì)胞激活型抗原[9]。NK細(xì)胞和 T細(xì)胞經(jīng)活化后，CD96的表達(dá)會明顯上調(diào)[10-11]。脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR，CD155，Necl5) 是目前人體中唯一確定的與CD96相互作用的分子[12-13]。CD96與CD155相互作用介導(dǎo)細(xì)胞粘附，促進(jìn)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷[14]。此外，CD96還被作為許多急性髓細(xì)胞性白血病的干細(xì)胞表面標(biāo)志物 (AML-LSCS)[15]。熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 分析表明，CD96在CD34+，CD38?AML 細(xì)胞中有大量表達(dá)[16]。

人的CD96分子在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)選擇性剪接形成兩個剪接體 (剪接體1和2)[9]。人CD96剪接體1的胞外有568個氨基酸，包含3個連續(xù)免疫球蛋白 (Ig) 結(jié)構(gòu)域 (V1，V2和 C)。它在鄰近跨膜區(qū)有一段富含絲氨酸/蘇氨酸/脯氨酸的柔性頸部區(qū)。該柔性頸部區(qū)高度糖基化。剪接體2由于在第2個Ig結(jié)構(gòu)域缺少外顯子4編碼的16個氨基酸，形成了C型或Ⅰ型Ig結(jié)構(gòu)域。它是CD96的主要表達(dá)形式[13]。人類CD96免疫球蛋白第1個IgV結(jié)構(gòu)域 (hCD96V1) 的N-端包含108個氨基酸 (殘基29-137)。Meyer等進(jìn)行的一項研究表明主要是 CD96第 1個 IgV結(jié)構(gòu)域參與了同CD155的結(jié)合[13]。

因此，對CD96第1個IgV結(jié)構(gòu)域的研究可以為靶細(xì)胞和活化的免疫細(xì)胞 (T細(xì)胞或NK細(xì)胞) 相互作用提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。本研究在大腸桿菌中以包涵體形式成功表達(dá)了人CD96第1個IgV結(jié)構(gòu)域 (hCD96V1)，并將其在體外復(fù)性。復(fù)性后的蛋白經(jīng)凝膠過濾和陰離子交換層析純化后用于晶體生長。我們采用座滴氣相擴(kuò)散法得到了CD96晶體，衍射分辨率為1.9?，為后續(xù)結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 pET21a-hCD96V1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.1.1 引物設(shè)計

目的片段為人類CD96 (GenBank Accession No. NM_005816) 第1個Ig V樣結(jié)構(gòu)域 (殘基29-137)，選擇適當(dāng)?shù)拿盖形稽c，并設(shè)計引物(表 1) 擴(kuò)增目的基因片段，用雙酶切 (XhoⅠ，Nde) Ⅰ過夜酶切目的載體 (pET21a) 和目的片段，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收后，直接進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，挑取克隆，通過菌液 PCR及酶切鑒定，并送測序。

表1 引物設(shè)計Table 1 Primers used in this study

1.2 hCD96V1的小量表達(dá)分析

將測序正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落接種到含終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)菌體密度(OD600) 達(dá)到約0.6時，加入終濃度1 mmol/L的異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG，Sigma公司) 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，37 ℃培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞并檢測目的蛋白表達(dá)情形。

1.3 hCD96V1的復(fù)性和分離純化及分析超速離心

將hCD96V1結(jié)構(gòu)域大量表達(dá)，采用透析復(fù)性的方式[17]進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的復(fù)性，復(fù)性緩沖液(4 mol/L尿素，100 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，400 mmol/L L-精氨酸，1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，5 mmol/L還原型谷胱甘肽，pH 8.0)；通過superdex75 10/300 GL柱 (GE Healthcare)和陰離子交換柱 resource Q進(jìn)一步純化復(fù)性后的蛋白，旨在得到一定濃度和純度的hCD96V1蛋白。

將制備好的蛋白濃縮 (蛋白濃度在A280=1.0 AU)，緩沖體系為 20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH 8.0。將測定樣品和空白對照(20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH 8.0)各取400 μL于離心機 (Beckman Coulter An-60)的比色杯中。轉(zhuǎn)動速度設(shè)置為54 000 r/min，每隔480 s測定紫外光的吸收譜，并用軟件計算沉降速率。

1.4 hCD96V1蛋白結(jié)晶、衍射、數(shù)據(jù)分析

將純化的 hCD96V1蛋白濃縮至一定體積后，使用Hampton research公司的Index試劑盒或其他試劑盒進(jìn)行蛋白結(jié)晶條件的初篩，1 μL蛋白與1 μL池液混合，并在200 μL池液的環(huán)境下采用291 K座滴氣相擴(kuò)散法嘗試結(jié)晶。得到良好的初篩結(jié)果后，將條件優(yōu)化，旨在得到衍射分辨率較高的晶體，進(jìn)行蛋白晶體的衍射和結(jié)構(gòu)的解析。數(shù)據(jù)收集時，hCD96V1蛋白單晶首先轉(zhuǎn)移到晶體防凍液中 (17%甘油，17%的 H2O和66%的池液) 浸泡30 s，迅速取出置于X-光下，于100 K收集數(shù)據(jù)。晶體衍射數(shù)據(jù)的收集在上海同步輻射 (SSRF)，光束線 BL17U1完成。衍射數(shù)據(jù)的處理通過HKL2000完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET21a-hCD96V1表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

hCD96V1基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化后，在 300 bp處可見特異性條帶，與理論大小一致 (圖 1A)。進(jìn)一步連接到pET21a(+) 載體中，雙酶切鑒定結(jié)果如圖 1B所示。

圖 1 hCD96v1的 PCR 產(chǎn)物鑒定 (A) 和pET21a-hCD96V1質(zhì)粒的雙酶切鑒定 (B)Fig. 1 PCR product of hCD96V1 gene fragment (A)and identification of the pET21a-hCD96V1 plasmid by enzyme digestion. (A) M: DL2 000 DNA marker; 1:PCR product (B) M: DNA marker. 1: pET21a-hCD96V digested with Xho I/Nde I.

2.2 hCD96V1的表達(dá)鑒定

將測序正確 pET21a-hCD96V1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆并進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h后，收集細(xì)菌并使用裂解液和超聲先后進(jìn)行化學(xué)和物理裂解，將裂解后的菌液離心，并分別取上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE電泳分析 (分離膠濃度為15%)。結(jié)果顯示 (圖2)，含CD96 V1沉淀樣品在分子量約為11 kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白帶，而在未誘導(dǎo)對照組和上清樣對照組中均未出現(xiàn)此條帶，說明CD96 V1結(jié)構(gòu)域在原核細(xì)胞中是可誘導(dǎo)表達(dá)的，并且主要以包涵體形式表達(dá)。

2.3 CD96 V1結(jié)構(gòu)域的蛋白純化及分析超速離心

圖2 SDS-PAGE鑒定CD96V1的誘導(dǎo)表達(dá)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of CD96V1 expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). 1: standard protein marker; 2: a single colony was picked and incubated in Luria-Bertani (LB) medium containing 100 μg/mL ampicillin at 310 K for 4 hours without adding isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG; Sigma, USA); 3:when the culture density (OD600) reached about 0.6,1 mmol/L IPTG was added to the culture and the cells were induced at 310 K for 4 h. Proteins of CD96V1 were expressed as inclusion bodies.

通過大規(guī)模培養(yǎng)大腸桿菌并使其誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，提取包涵體。隨后利用透析復(fù)性的方法對包涵體進(jìn)行復(fù)性，并進(jìn)一步通過分子篩純化，hCD96V1出峰位置在12.33 mL，分子量大約為24 kDa，hCD96V1單體分子量約為12 kDa(圖 3)，收集主峰位置的蛋白，進(jìn)一步用陰離子交換層析方法獲得了高純度且均一的可溶性hCD96V1蛋白。分析超速離心的結(jié)果說明hCD96V1在溶液中大多數(shù)以二聚體的形式存在，并含有少量的四聚體 (圖4)。

2.4 hCD96V1蛋白的結(jié)晶

將 hCD96V1蛋白樣品濃縮至濃度為5～10 mg/mL (緩沖液體系為：20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl)。采用座滴氣相擴(kuò)散法在18 ℃恒溫條件下進(jìn)行結(jié)晶條件初篩，在Hampton Research公司的Index Kit 92號條件獲得晶體 (圖5) (結(jié)晶條件為0.1 mol/L甲酸鎂水合物，15% (W/V) 聚乙二醇3 350)。衍射分辨率為1.9? (圖6)。晶體衍射數(shù)據(jù)集統(tǒng)計匯總于表2。晶體空間群為P21，晶胞參數(shù)為 a=35.1，B=69.5，C=49.6?，β=105.4°。

圖3 hCD96V1結(jié)構(gòu)域的蛋白純化Fig. 3 Gel-filtration profile of refolded hCD96V1 by Superdex 75 10/300 GL column (column volume:24 mL; GE Healthcare). The elution volume is about 12.33 mL. The inserted figure is a migration profile of the purified protein on a reduced SDS-PAGE gel (15%).The molecular weight markers (Lane M) are in indicated.

圖4 hCD96V1結(jié)構(gòu)域的蛋白分析超速離心結(jié)果Fig. 4 The analytical ultracentrifugation result of the first domain of human CD96. The majority of CD96 V1 forms dimer with approximate molecular weight of 26.9 kDa. A small percentage of CD96 also forms tetramer with approximate molecular weight of 51.8 kDa.

研究發(fā)現(xiàn)CD96廣泛表達(dá)于各種組織中[18]，并且可能具有多種生物學(xué)作用[18]，但目前的研究主要集中在它在NK細(xì)胞殺傷中的作用，以及它可以作為急性髓細(xì)胞性白血病的干細(xì)胞的marker，其他的功能有待進(jìn)一步研究。a

圖5 hCD96V1結(jié)構(gòu)域的蛋白晶體Fig. 5 Crystals of the hCD96V.

圖6 hCD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白晶體衍射圖Fig. 6 X-ray diffraction image of the human CD96 1st V-domain crystal.

表2 衍射數(shù)據(jù)Table 2 Data collection statistics

我們用BLAST將CD96與已知蛋白序列進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)與CD96分子同源性較高的蛋白分子有 CD86、CD113、CD166 和 CD226 等[19]。而研究表明這些分子均具有一定的介導(dǎo)細(xì)胞粘附功能[20]。其中同源性最高的為CD226，已有的研究表明 CD226與 CD96識別共同的配體CD155[18,21]，介導(dǎo)NK和T細(xì)胞活化和殺傷[22]。CD96和 CD226的同源性主要在胞膜外 N-端的第一Ig樣結(jié)構(gòu)域，同源性29%，推測二者的D1可能采用相似的方式與配體識別和結(jié)合。除此之外，與CD96的第一蛋白結(jié)構(gòu)域同源性較高的是Nectin-1的第 1蛋白結(jié)構(gòu)域 (V-set)，但也僅為23%。而其他已知結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子與人類CD96的同源性更低，因此用分子置換法解析hCD96V1的結(jié)構(gòu)尚有難度。我們嘗試用硒代等方法解析其結(jié)構(gòu)，但未能成功。

盡管結(jié)構(gòu)仍然沒有解析，然而hCD96V1蛋白的復(fù)性成功對于進(jìn)一步解析CD96結(jié)構(gòu)、CD96與其配體CD155復(fù)合體結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。hCD96與其配體相互作用模式對于NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機制的研究具有重要參考價值。

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November 23, 2012; Accepted: January 8, 2013

Ning Guo. Tel/Fax: +86-551-65786216; E-mail: guoning-guo@yahoo.com.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 31030030) 資助。

Expression, crystallization and crystallographic study of the 1stIgV domain of human CD96

Wenjing Jiang1,2, Shuijun Zhang2, Jinghua Yan2, and Ning Guo1

1School of Life Science,Anhui Agricultural University,Hefei230036,Anhui,China
2CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

CD96 (Tactile) is an adhesion receptor expressed mainly on activated T cells, NK cells. As a family member of the immunoglobulin-like cell receptor, CD96 consists of three immunoglobulin-like domains (V1, V2/C and C) in the extracellular region. Recent studies have shown that the 1stIgV domain of CD96 (CD96V1) plays an essential role in cell adhesion and NK cell-mediated killing. In this study, the 1stIgV domain of human CD96 (hCD96V1) was cloned and expressed inEscherichia coli(BL21). The soluble protein was obtained by refolding of the hCD96V1 inclusion bodies.From analytical ultracentrifugation, we could predict that CD96 V1 maily exists as dimer with approximate molecular weight of 26.9 kDa. The protein was then successfully crystallized using the sitting-drop vapour-diffusion method. The crystals diffracted to 1.9 ? resolution and belonged to space groupP21, with unit-cell parametersa=35.1,b=69.5,c= 49.6?,α=γ=90°, β=105.4°.

CD96, 1stV domain, cell adhesion molecules, protein purification, crystallization

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31030030).

(本文責(zé)編 郝麗芳)