于霞 趙立平 姜廣路 馬異峰 黃海榮

結(jié)核病疫情的不斷蔓延是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，目前全球已有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，而活動(dòng)性結(jié)核病患者達(dá)1500萬例，每年新增結(jié)核病患者約800～1000萬例，每年有180萬例因結(jié)核病死亡［1］。耐多 藥結(jié)核病 （multidrug－resistant tuberculosis，MDR－TB）是指體外至少對異煙肼（H）和利福平（R）同時(shí)耐藥的結(jié)核病。MDR－TB的治療與普通結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)一線藥物治療相比，治療效果差，不良反應(yīng)多且治療費(fèi)用高，已經(jīng)成為成功控制結(jié)核病的障礙。

磺胺是最早發(fā)現(xiàn)的具有抗菌作用的藥物，磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole，SMX）又稱新諾明（sinomine），是磺胺類藥物中常用的抗生素，通常與甲氧芐啶（trimethoprim，TMP）聯(lián)合用于臨床治療。SMX和TMP均作用于細(xì)菌的葉酸合成途徑，SMX作用于二氫喋呤合成酶，從而阻止其將對氨基苯甲酸催化成二氫葉酸，而TMP則作用于二氫葉酸還原酶，從而阻止其將二氫葉酸還原成四氫葉酸［2］。目前，廣泛使用的復(fù)方新諾明就是TMP和SMX的復(fù)方制劑，其中SMX的含量為TMP的5倍。早在20世紀(jì)30—50年代，磺胺類藥物就單獨(dú)用來治療肺結(jié)核。但隨著20世紀(jì)50年代具有更強(qiáng)殺菌效果的H和鏈霉素（S）出現(xiàn)后，磺胺類藥物就基本不再用于結(jié)核病的治療。但迫于MDR－TB患者的不斷增多，磺胺類藥物又以抗結(jié)核藥物的形式被推薦［3］，已有研究表明，磺胺類藥物在體內(nèi)外對于結(jié)核病的治療具有良好的療效［4］。

本研究的目的是評價(jià)TMP和SMX的聯(lián)合應(yīng)用對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的體外抑菌作用。同時(shí)因抗結(jié)核治療是一個(gè)聯(lián)合化療的過程，也因此對TMP和（或）SMX與其他抗結(jié)核藥物如R、H、乙胺丁醇（E）、S、卡那霉素（Km）、氧氟沙星（Ofx）、利福布?。≧fb）的體外協(xié)同作用進(jìn)行了評價(jià)。

材料和方法

一、材料

1．菌株來源：H37Rv（ATCC 27294）和120株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來源于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室，菌株收集時(shí)間為2010年9月至2010年11月。納入的121株結(jié)核分枝桿菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果均是由絕對濃度法（羅氏含藥培養(yǎng)基）藥敏試驗(yàn)確定，包括MDR菌株32株，非MDR耐藥菌株36株，敏感株53株。

2．試 劑 和 藥 品：SMX（S7507，10g）、TMP（T7883，5g）、R（R3501，5g）、H（I3377，50g）、S（S6501，25g）、E（E4630，25g）、Km（K400，5g）、Ofx（O8757，10g）、Rfb（R3530，25mg）均購自美國Sigma公司；96微孔板（Corning，美國）；Alamar blue（Serotec，英國）；7H9（Difco，美國）；OADC（BD，美國）；Tween－80、二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）和氫氧化鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為化學(xué)分析純。

二、方法

1．微孔板 Alamar blue法（microplate alamar blue assay，MABA）：具體的操作步驟參見參考文獻(xiàn)［5］。藥物的終濃度分別為：SMX 為（0．63～160）μg／ml；TMP為（0．125～32）μg／ml；“TMP∶SMX＝1∶5”為（0．13／0．63～16／80）μg／ml；“TMP∶SMX＝1∶19”為（0．031／0．6～4／76）μg／ml；R為（0．0625～8）μg／ml；H 為（0．0125～1．6）μg／ml；S為（0．125～16）μg／ml；E 為 （0．3125～40）μg／ml；Km 為（0．3125～40）μg／ml；Ofx 為（0．125～16）μg／ml；Rfb為（0．03125～4）μg／ml，SMX、TMP、R、Rfb用DMF溶解，H、S、E、Km用水溶解，Ofx用1%氫氧化鈉溶解，上述藥物濃度均由最高濃度進(jìn)行2倍稀釋，每種藥物包括8個(gè)梯度濃度，每種藥物濃度重復(fù)2孔。選取羅氏培養(yǎng)基上生長2～3周的新鮮菌落，用玻璃珠磨菌，稀釋至1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛龋跰cFarland 1，相當(dāng)于（3～6）×107CFU／ml］，再以1∶25稀釋后向微孔板加入100μl菌液，菌液的終濃度約為106CFU／ml。每個(gè)菌株設(shè)1個(gè)不含藥物的生長對照孔（陽性對照）和只含有7H9不含藥物和菌液的無菌對照孔（陰性對照），各菌株平行進(jìn)行2次測試。96孔板于37℃孵育5d后在生長對照孔加入20μl Alamar blue和50μl Tween－80（5．00%）的混合液，37℃孵育24h，如果顏色從藍(lán)色變?yōu)榉凵?，則在各實(shí)驗(yàn)藥物孔內(nèi)加入上述量的 Alamar blue和Tween－80混合液，37℃孵育24h記錄各孔的顏色，藍(lán)色孔為無生長，粉紅色孔為有生長。如出現(xiàn)紫紅色孔，則繼續(xù)在37℃培養(yǎng)24h，如果不變?yōu)榉奂t色且其相連的藍(lán)色孔仍為藍(lán)色，則記錄為有生長。MIC定義為阻止顏色變化 （從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色）的最低藥物濃度。

2．藥物聯(lián)合作用：選取18株臨床分離株（5株MDR，13株非 MDR）和 H37Rv（ATCC 27294）（18株選擇為分層整群抽樣設(shè)計(jì)，即先按照MDR菌株和非MDR菌株進(jìn)行分層，總體MDR菌株∶非MDR菌株＝32∶89，本次抽樣的總數(shù)為18例，按照32∶89比例約為5株MDR菌株，13株非MDR菌株）進(jìn)行藥物相互作用試驗(yàn)。SMX與R、H、E、S、Km、Ofx、Rfb聯(lián)合用藥的 MIC通過 MABA法測定，每個(gè)菌株平行做2次測試。聯(lián)合用藥中每種抗結(jié)核藥的濃度范圍是1／32到4×MIC（9個(gè)濃度，每個(gè)濃度間的梯度值是2倍）。采用分級(jí)抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）來計(jì)算藥物間的相互作用。FICI＝MIC甲藥聯(lián)用／MIC甲藥單用＋MIC乙藥聯(lián)用／MIC乙藥單用［6－7］。FICI≤0．5，協(xié)同作用；0．5＜FICI＜1，加合作用；1≤FICI＜4，無關(guān)作用；FICI≥4，拮抗作用［6］。臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦慢生長分枝桿菌對于TMP聯(lián)合SMX的MIC≤1／19μg／ml為敏感菌株。質(zhì)控方法同MABA法。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MDR菌株、非MDR菌株、敏感菌株間MIC的比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TMP和SMX的體外抑菌活性

1．不同耐藥類型結(jié)核分枝桿菌SMX、TMP、TMP聯(lián)合SMX的MIC：TMP對于結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌效果較差，117 株菌株 （117／121，96．70%）的 MIC＞32μg／ml（包括 H37Rv），另外4株菌株的 MIC分別為8μg／ml、8μg／ml、16μg／ml、16μg／ml。TMP和SMX對121株不同耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌的MIC具體見表1。

2．不同耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌SMX和“TMP∶SMX＝1∶5”的 MIC分布：SMX和“TMP∶SMX＝1∶5”對于敏感菌株組（53株）、MDR菌株組（32株）和非MDR耐藥菌株組（36株）的MIC分布如表2所示。107株（107／121，88．43%）可以被20 μg／ml 的 SMX 抑 制 生 長，109 株 （109／121，90．08%）可以被“5μg／ml TMP＋20μg／ml SMX”抑制生長。對于結(jié)核分枝桿菌，TMP和SMX聯(lián)合應(yīng)用未表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)（單用TMP殺菌時(shí)絕大部分 MIC＞32μg／ml，TMP、SMX聯(lián)合用藥和單獨(dú)使用SMX的MIC基本一致，故認(rèn)為TMP和SMX在殺傷結(jié)核分枝桿菌上無協(xié)同作用）。單獨(dú)使用SMX和“TMP∶SMX＝1∶5”的MIC分布對于121株結(jié)核分枝桿菌的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（成組設(shè)計(jì)秩和檢驗(yàn)Z＝－0．3，P＝0．764）。

表1 不同耐藥類型結(jié)核分枝桿菌的SMX、TMP、TMP聯(lián)合SMX體外抑菌活性

表2 不同耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌SMX和“TMP∶SMX＝1∶5”的MIC分布（株）

3．121株結(jié)核分枝桿菌“TMP∶SMX＝1∶19”的MIC分布：“TMP∶SMX＝1∶19”對于敏感菌株、MDR菌株和非MDR耐藥菌株的MIC分布如圖1所示，3組“TMP∶SMX＝1∶19”對不同耐藥類型菌株的 MIC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．111，P＝0．946）。3組菌株的“TMP∶SMX＝1∶19”的MIC 主 要集中在 “0．5μg／ml TMP＋9．5μg／ml SMX”和“1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”，在敏感菌株、MDR菌株和非MDR耐藥菌株中分別占86．79% （46／53）、75．00% （24／32）和 86．11%（31／36）。納入的 121 株 菌株 中，109（109／121，90．08%）株 可 以 被 “1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”抑制生長，5株的 MIC為“2μg／ml TMP＋38μg／ml SMX”，僅有7株的 MIC≥“2μg／ml TMP＋38μg／ml SMX”，包括敏感株5株，MDR菌株2株。

圖1 121株結(jié)核分枝桿菌對“TMP∶SMX＝1∶19”的MIC分布圖

4．SMX與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用的MIC：SMX與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用對H37Rv和18株臨床分離株的抑制作用見表3和表4。對于H37Rv，SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合用藥后，除了Rfb表現(xiàn)出協(xié)同作用，其余藥物均表現(xiàn)為無關(guān)作用。對18株臨床分離株，SMX 與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合用藥后，14（14／18，77．78%）表現(xiàn)為與Rfb協(xié)同。1株表現(xiàn)為與Ofx協(xié)同，其余藥物聯(lián)合作用的效果主要表現(xiàn)為無關(guān)。

表3 SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)用對H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的作用

表4 SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)用對18株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的作用

討 論

我國2008年耐藥基線調(diào)查數(shù)據(jù)表明，目前常規(guī)抗結(jié)核藥物耐藥形式非常嚴(yán)峻，對于一線抗結(jié)核藥物H、R、E和S，初治患者的耐藥率分別為16%、6．7%、4．9%和27．7%，而對于復(fù)治患者則分別上升至38．5%、29．4%、17．2%和37．2%［8］，急需發(fā)現(xiàn)新的抗結(jié)核分枝桿菌藥物或是開發(fā)傳統(tǒng)藥物的抗結(jié)核效果。一系列的研究均表明磺胺類藥物具有潛在的抗結(jié)核療效。2009年，一篇關(guān)于單獨(dú)應(yīng)用SMX治療MDR－TB患者顯效的報(bào)道引起了對磺胺類藥物治療結(jié)核病的關(guān)注［4］。同時(shí)該研究也表明在44株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中有98%可以被“1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”抑 制 生 長。Huang等［9］研究表明納入的117株結(jié)核分枝桿菌中80%可以被“1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”抑制。本研究的數(shù)據(jù)與上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本一致，但鑒于各國流行菌株耐藥情況的差異，以及測定MIC時(shí)采用培養(yǎng)基的不同（7H10、7H11和7H9），以致敏感度的數(shù)據(jù)還存在一定的差異。

磺胺類藥物問世已經(jīng)有50余年歷史，由于其價(jià)格低廉且無明顯的不良反應(yīng)而在臨床廣泛應(yīng)用。對流感嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌也有較好的抑菌效果，García－Cobos等［10］研究表明109株流感嗜血桿菌有38%對TMP聯(lián)合SMX耐藥，耐藥臨界值為MIC≥4μg／ml，MIC范圍為≤0．25～32μg／ml。對于金黃色葡萄球菌，耐藥臨界值為1．6μg／ml，4210份菌株中有81（81／4210，1．92%）株對 TMP聯(lián)合SMX 耐 藥，MIC 范 圍 為 0．25～16．00μg／ml，97．5%的菌株 MIC集中在0．25μg／ml［11］。本研究表明TMP聯(lián)合SMX對于結(jié)核分枝桿菌也有較好的抑菌作用，CLSI推薦慢生長分枝桿菌對于TMP＋SMX復(fù)方制劑的 MIC以≤（1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX）為敏感菌株。按照此判定標(biāo)準(zhǔn)，109株（109／121，90．08%）對 TMP＋SMX復(fù)方制劑敏感。并且TMP＋SMX復(fù)方制劑對于結(jié)核分枝桿菌的抑菌效果與細(xì)菌本身的耐藥類型不相關(guān)，MIC在MDR組（32株）、敏感組（53株）和非 MDR耐藥組（36株）之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．111，P＝0．946）。

結(jié)核病的治療以化療為核心，聯(lián)合用藥為化療的基本原則，目的是利用多種抗結(jié)核藥物的交叉殺菌作用，提高殺菌、抑菌的能力，保證療效和防止產(chǎn)生耐藥性［12］。本次研究結(jié)果表明，TMP在體外對結(jié)核分枝桿菌抑菌效果很差，在藥物濃度為32μg／ml時(shí)，對于96．70%（117／121）的細(xì)菌依然沒有抑菌效果。因此，本研究僅對SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合用藥的效果進(jìn)行評價(jià)。在18株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，有14株（14／18，77．78%）表現(xiàn)出 SMX與Rfb之間有協(xié)同性。對于H37Rv，SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合用藥后，除Rfb表現(xiàn)出協(xié)同作用外，其他藥物均表現(xiàn)為無關(guān)。

本研究證實(shí)納入研究的121株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株有 90．08%（109／121）可以被 “1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”劑量的復(fù)方制劑所抑制。Vilchèze等［13］研究表明，口服“960mg TMP＋4．8g SMX”劑量的復(fù)方制劑之后，TMP的血藥濃度可以達(dá)到4．4μg／ml，SMX 的血藥濃度可以達(dá)到81．5 μg／ml。Alsaad等［14］研究表明，10例采用復(fù)方新諾明進(jìn)行抗結(jié)核治療的MDR－TB患者，口服480mg的復(fù)方新諾明后，平均的fAUC0－24／MIC比值為10．8。因此，從理論上講SMX可以抑制體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的生長，也非常有希望成為潛在的抗結(jié)核治療藥物，但需要更多的體內(nèi)和體外試驗(yàn)對其抗結(jié)核療效進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)。

本研究雖然對磺胺類藥物對結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌作用進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和評價(jià)，但由于試驗(yàn)技術(shù)所限，仍存在以下不足：（1）雖然國內(nèi)外研究均有使用MABA法檢測抗生素對結(jié)核分枝桿菌MIC的報(bào)道［15－18］，且該法對于 H和R的 MIC檢測結(jié)果可靠［15］，但對于TMP和（或）SMX檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性尚無定論。（2）MABA法作為初步檢測TMP和（或）SMX對于Mtb的MIC的方法結(jié)果比較可靠，但要慎重判讀處于耐藥臨界值附近的MIC值。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局，中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國疾病預(yù)防控制中心．中國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南（2008年版）．北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009：1．

［2］Huovinen P．Resistance to trimethoprim－sulfamethoxazole．Clin Infect Dis，2001，32（11）：1608－1614．

［3］Young LS．Reconsidering some approved antimicrobial agents for tuberculosis．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（11）：4577－4579．

［4］Forgacs P，Wengenack NL，Hall L，et al．Tuberculosis and trimethoprim－sulfamethoxazole．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（11）：4789－4793．

［5］Franzblau S，Witzig R，McLaughlin J，et al．Rapid，low－technology MIC determination with clinicalM．tuberculosisisolates by using the Microplate Alamar Blue Assay．J Clin Microbiol，1998，36（2）：362－366．

［6］Lewis RE，Diekema DJ，Messer SA，et al．Comparison of E－test，chequerboard dilution and time－kill studies for the detection of synergy or antagonism between antifungal agents tested against Candida species．J Antimicrob Chemother，2002，49（2）：345－351．

［7］Ge F，Zeng F，Liu S，et al．In vitrosynergistic interactions of oleanolic acid in combination with isoniazid，rifampicin or ethambutol againstMycobacterium tuberculosis．J Med Microbiol，2010，59（5）：567－572．

［8］Zhao Y，Xu S，Wang L，et al．National survey of drug－resistant tuberculosis in China．N Engl J Med，2012，366（23）：2161－2170．

［9］Huang TS，Kunin CM，Yan BS，et al．Susceptibility ofMycobacterium tuberculosisto sulfamethoxazole，trimethoprim and their combination over a 12year period in Taiwan．J Antimicrob Chemother，2012，67（3）：633－637．

［10］García－Cobos S，Campos J，Cercenado E，et al．Antibiotic resistance in Haemophilus influenzae decreased，except for betalactamase－negative amoxicillin－resistant isolates，in parallel with community antibiotic consumption in Spain from 1997to 2007． Antimicrob Agents Chemother， 2008，52 （8）：2760－2766．

［11］Richter SS，Heilmann KP，Dohrn CL，et al．Activity of ceftaroline and epidemiologic trends inStaphylococcus aureusisolates collected from 43medical centers in the United States in 2009．Antimicrob Agents Chemother，2011，55（9）：4154－4160．

［12］馬玙，朱莉貞，潘毓萱．結(jié)核病．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：507－531．

［13］Vilchèze C，Jacobs WR Jr．The combination of sulfamethoxazole，trimethoprim，and isoniazid or rifampin is bactericidal and prevents the emergence of drug resistance inMycobacterium tuberculosis．Antimicrob Agents Chemother，2012，56（10）：5142－5148．

［14］Alsaad N，van Altena R，Pranger AD，et al．Evaluation of cotrimoxazole in treatment of multidrug－resistant tuberculosis．Eur Respir J，2012［Epub ahead of print］．

［15］Leonard B，Coronel J，Siedner M，et al．Inter－and intra－assay reproducibility of microplate Alamar blue assay results for isoniazid，rifampicin，ethambutol，streptomycin，ciprofloxacin，and capreomycin drug susceptibility testing ofMycobacterium tuberculosis．J Clin Microbiol，2008，46（10）：3526－3529．

［16］Yu X，Jiang G，Li H，et al．Rifampin stability in 7H9broth and L?wenstein－Jensen medium．J Clin Microbiol，2011，49（3）：784－789．

［17］黃海榮，于霞，姜廣路，等．利奈唑胺對分枝桿菌體外抑菌作用的初步研究．中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34（8）：575－578．

［18］陸宇，鄭梅琴，王彬，等．氯法齊明抗結(jié)核分枝桿菌的體內(nèi)外活性研究．中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31（10）：752－501．