江雪豐 周希瑗

多貝斯干預前后TSP-1在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達

江雪豐 周希瑗

目的 檢測TSP-1在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達并探討其作用。方法 采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導大鼠糖尿病模型, 成模后隨機分成兩組,糖尿病組和多貝斯組,其中, 多貝斯治療組在出現(xiàn)糖尿病表現(xiàn)后按100 mg/kg/d, 糖尿病組和正常對照組只在同期灌胃等量生理鹽水。注射后1、3個月采用免疫組織化學方法檢測視網(wǎng)膜中TSP-1陽性反應及其分布。結果 各組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)陽性著色的積分光密度值均較正常組降低(P＜0.05)。結論 TSP-1蛋白質(zhì)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達明顯降低并與病程有關, 提示TSP-1表達不足可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的原因之一。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；免疫組織化學；血小板反應蛋白-1, 多貝斯

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥, 是不可逆性失明的重要原因［1］,其發(fā)病機理比較復雜, 受多種血管刺激因子和抑制因子調(diào)控。血小板反應蛋白-1(thrombospondin-l, TSP-1)已被公認為一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制因子。作者通過研究TSP-1蛋白在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達, 探討其可能在DR中意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型建立 實驗用封閉群雄性Wistar大鼠60只, 體質(zhì)量180~280 g, 標準條件飼養(yǎng), 不限飲食。實驗前禁食12h, 自由飲水。將鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ;Sigma公司)按65 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射, 注射后24~48h檢測血糖濃度達16.65 mmol/L, 尿糖達+++-~++++為模型建立成功。成模后隨機分為糖尿病組(10只x 2)、多貝斯治療組(10只x 2), 另取20只正常大鼠作為正常對照組。多貝斯治療組在出現(xiàn)糖尿病表現(xiàn)后按100 mg(kg·d)灌胃, 糖尿病組和正常對照組灌胃等量生理鹽水。

1.2 眼球標本的取材和制片 分別于1月、3月將各組大鼠以體積分數(shù)10%水合氯醛腹腔麻醉。摘除眼球, 固定,沖洗、脫水、透明, 浸蠟, 包埋, 備用。連續(xù)6μm切片用于免疫組化。

1.3 各組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1檢測 采用免疫組織化學SP法, 主要操作步驟為：切片脫蠟、水化； 3%H2O2滅內(nèi)源性過氧化物酶活性；微波修復抗原, 封閉非特異性抗原；滴加TSP-1一抗(稀釋度為1：100), 4℃過夜； 滴加生物素化二抗及辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液, DAB顯色, 蘇木精復染,常規(guī)梯度乙醇脫水, 透明, 膠封、鏡檢。

1.4 圖像采集分析 采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)測定視網(wǎng)膜TSP-1的積分光密度進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SAS 10.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析, 以(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

各組TSP-1免疫組織化學染色結果

光鏡觀察1個月時, 正常對照組中TSP-1蛋白質(zhì)的陽性反應表達分布于視網(wǎng)膜的內(nèi)界膜、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層, 呈深棕黃色；TSP-1蛋白質(zhì)在糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜的表達空間范圍同正常組,呈棕黃色, 與正常組比較明顯下降, 內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層降低尤為明顯,P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義, 多貝斯干預組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達也降低, 基本同糖尿病組；3個月時, 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達較正常對照組顯著降低, 尤其在內(nèi)叢狀層、外叢狀層呈極微弱的陽性表達, 而多貝斯干預組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達呈中等程度, 陽性反應程度及表達區(qū)域較同時期糖尿病組顯著增加(見表1)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中TSP-1平均積分光密度值的圖像分析結果s)

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中TSP-1平均積分光密度值的圖像分析結果s)

注：a表 示和糖尿病組比較P＜0.05

組別1個月3個月正常對照組26.34±3.40a25.91±3.31a糖尿病組21.5±3.0215.93±2.41多貝斯組22.43±3.5923.23±3.16*

3 討論

DR是糖尿病微血管并發(fā)癥之一, 基本病理過程表現(xiàn)為微循環(huán)障礙, 主要病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜血管滲透性增加, 新生血管形成, 最終導致視功能不可逆性損害［2］。TSP-l已被公認為一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制因子, 在體外可直接抑制兔黃體、牛腎上腺皮質(zhì)、肺動脈以及人臍靜脈的內(nèi)皮細胞增殖, 這種抑制作用可被抗TSP-1的單克隆抗體所中和［3-5］。有研究表明, 在氧誘導的缺血性視網(wǎng)膜病變過程中TSP-1的表達增加可使視網(wǎng)膜前新生血管減弱［3］。有報道發(fā)現(xiàn)TSP-1在視網(wǎng)膜周細胞的增殖擴散和遷移中起了重要作用并影響視網(wǎng)膜血管的發(fā)育和動態(tài)平衡［6］。TSP-1的抗血管新生作用受到眾多學者關注。

本試驗表明, TSP-1免疫陽性反應在正常大鼠視網(wǎng)膜中表達較強, 主要表達于內(nèi)界膜、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層 。而在 STZ誘導的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中, TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達比正常大大減弱, 并隨病程的延長有逐漸減少的趨勢, 表達的空間范圍亦有所縮小, 藥物組中TSP-1的表達升高?？紤]多貝斯是臨床療效確切的DR微血管保護劑, 可有效改善視網(wǎng)膜微循環(huán), 促進DR病情的穩(wěn)定或改善。上述免疫組化結果表明TSP-1在眼部血管自身穩(wěn)定中起一定的重要作用以及它的降低與早期糖尿病相關的血管異常有關,其作用機制有待進一步研究。

［1］ Studholme S. Diabetic retinopathy . J Perioper Pract, 2008,18(5):205 -210.

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［3］ Wu Z,Wang S, Sorenson CM, et al.Attenuation of retinal vascular development and neovascularization in transgenic mice over—expressing thrombospondin-I in thelens.Dev Den, 2006, 235(7):1908-1920.

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330009 江西省南昌市第三醫(yī)院眼科(江雪豐)； 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科(周希瑗)

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