謝林靜，韓宇馳

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090)

隨著化石能源的日益短缺以及燃燒化石燃料所造成的環(huán)境污染加劇，近年來生物柴油作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)石油的新型能源燃料而備受關(guān)注［1］.微藻作為生物柴油原料的研究始于20 世紀60 年代［2］，近幾年來該類研究得到了迅猛發(fā)展.前期研究發(fā)現(xiàn)，小球藻(Chlorella protothecoides)含有豐富的糖、脂類、蛋白質(zhì)、葉綠素等，其細胞中的脂肪類含量約為4.5～85%［3］.因此，小球藻已經(jīng)成為制備生物柴油的理想原料之一.

在小球藻的培養(yǎng)過程中，光照強度、溫度、初始pH 值、通氣量和培養(yǎng)基成分等都會影響小球藻的生物量累積和油脂生成.而這些因素中培養(yǎng)基的成分是最關(guān)鍵的因素之一.碳源對處于異養(yǎng)狀態(tài)的小球藻具有較大的影響，不同的碳源對小球藻在異養(yǎng)時的生長狀態(tài)和內(nèi)部成分合成狀態(tài)的影響各不相同［4，5］，對小球藻的生物量累積和油脂生成的影響也不一樣.

該研究以葡萄糖和乙酸鈉為碳源，對比分析兩者對小球藻的生物量與產(chǎn)油量的影響，探討小球藻利用有機碳源的規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 小球藻的培養(yǎng)

藻株C.protothecoides 由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫提供.小球藻的培養(yǎng)在250～500 mL 錐形瓶中進行，其瓶塞經(jīng)過特殊處理可以用來進行被動氣體交換.培養(yǎng)基采用的是SE(Birstrol’s solution)培養(yǎng)基［6］.初始pH 設(shè)定在6.8，接種量為15%，培養(yǎng)溫度為28℃，通氧量保持在50 mL/d，搖速設(shè)定在140 rpm.在研究葡萄糖濃度對小球藻生物量與產(chǎn)油量的影響時，在7 個錐形瓶內(nèi)分別投入30、25、20、15、10、5、和0 g/L 的葡萄糖，在如前所述的條件下同時接種并培養(yǎng).在研究乙酸鈉濃度的影響時，在7 個錐形瓶內(nèi)分別投入24.6、20.5、16.4、12.3、8.2、4.1 和0 g/L 的乙酸鈉.研究乙酸鈉與葡萄糖的混合培養(yǎng)對小球藻的生長和油脂累積的影響時，在6 個錐形瓶內(nèi)分別投入(葡萄糖/乙酸鈉)0 g/20.5 g、3 g/16.4 g、6 g/12.3 g、9 g/8.2 g、12 g/4.1 g 和15 g/0 g 的混合有機碳源，并在如前所述的條件下同時接種并培養(yǎng)，具體的分組情況見表1.實驗中的小球藻均在168 h 后采樣檢測.

表1 不同燒瓶編號中的葡萄糖與乙酸鈉的投加比例Tab.1 The proportion of glucose and sodium acetate in different flasks

1.2 小球藻生物量的采收方法

試驗中采用了離心法采收小球藻，將生長到研究需要階段的藻液轉(zhuǎn)移到離心管中，放入離心機，在轉(zhuǎn)速為4 000 rpm 的條件下離心5 min，去除上清液，將下層濃縮藻泥放入冰箱中冷凍30 min 后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中干燥24 h.取出后保存在4℃的冰箱中備用.

1.3 小球藻生物量的測定方法

取4 mL 藻液置于已稱重的5 mL 離心管中，在5 000～7 000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心5 min，去上清液.并放于烘干箱中在65℃下烘干至恒重，同時測量三個平行樣，取平均值.

1.4 小球藻油脂的提取方法

小球藻油脂的提取所采用的方法是正己烷與異丙醇相結(jié)合的提取方式，每4 g 干重的微藻添加300 mL 的提取液，其中正己烷和異丙醇的體積比例為3∶2.錐形瓶的瓶口用鋁箔紙密封防止氣體揮發(fā)，并且在800 rpm 的轉(zhuǎn)速下反應(yīng)8 h.細胞殘留物使用Whatman GF/C 濾紙去除.濾液被轉(zhuǎn)入分液漏斗并加入40 mL 水作為誘導(dǎo)兩相穩(wěn)定的引導(dǎo)劑.當混合溶劑分離出兩個不同的層面時，上層深綠色的正己烷層包含的是被提取的油脂，下層淺綠色水醇混合層包含的是非油脂類藻細胞雜質(zhì).正己烷層的液體將被移入到一個事先稱量過的容器中，并在干燥箱內(nèi)以60℃的溫度蒸發(fā).蒸發(fā)使得脂肪類重量量化烘干.最終的油脂量通過重新稱重獲得.

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖濃度對小球藻的生長與產(chǎn)油的影響

葡萄糖濃度對C.protothecoides 的生物量與油脂累積的影響結(jié)果如圖1 所示.由圖可見，在沒有葡萄糖或者微量濃度存在時，藻類的生長受到抑制，同時油脂累積量也不大.而隨著葡萄糖濃度遞增到15 g/L 時，含油量從10%升高到30%左右.但是隨著葡萄糖濃度的進一步提高，小球藻的生物量和含油量會有所降低.由此可見，小球藻的生長和含油量的累積與葡萄糖的濃度有密切的關(guān)系.

圖1 葡萄糖濃度對C.protothecoides 的生物量與油脂累積影響Fig.1 Effects of glucose concentrations on the cell growth and oil accumulation of C.protothecoides

2.2 乙酸鈉濃度對小球藻的生長與產(chǎn)油的影響

乙酸鈉作為葡萄糖之外的另一種有機物，已經(jīng)被證實可以被多種細菌和植物在呼吸作用中直接被利用［7，8］.筆者以小型分子有機酸乙酸鈉作為有機碳源培養(yǎng)C.protothecoides，研究其濃度對小球藻的生長與產(chǎn)油的影響，結(jié)果如圖2 所示.在乙酸鈉濃度為20.5 g/L 左右時，小球藻的生物量和含油量達到最大值.隨著濃度的繼續(xù)增加，生物量和含油量有明顯的下降.由此可見，使用小分子有機酸作為碳源培養(yǎng)C.protothecoides 是可行的.

2.3 葡萄糖和乙酸鈉對小球藻影響的對比分析

為了對比分析葡萄糖和乙酸鈉在生物量累積與油脂累積中的效果，我們用生長曲線來比較分析生物量的差異(圖3)，使用同當量的碳源濃度測試分析油脂累積的差異(圖4).由圖3 可知，在分別以葡萄糖和乙酸鈉和為碳源的兩組中，小球藻的生物量隨著時間的增加而不斷增加，在120 min 左右時，兩組的生物量達到平衡.相對于葡萄糖為碳源的小球藻來說，以乙酸鈉為碳源的小球藻的生物量要小一些.由圖4 可知，以葡萄糖為碳源的小球藻的含油量在各種濃度條件下都高于以乙酸鈉為碳源的小球藻的含油量，但兩者的最高含油量相差不大.

2.4 葡萄糖和乙酸鈉混合培養(yǎng)條件下小球藻的生長與產(chǎn)油情況分析

在上述單一碳源實驗中，乙酸鈉可以完全被小球藻利用.在這一部分，我們通過葡萄糖與乙酸鈉的混合培養(yǎng)，分析葡萄糖和乙酸鈉共存情況下的小球藻的生長和油脂累積情況，并進一步探討葡萄糖和乙酸鈉之間的區(qū)別與相互作用，實驗結(jié)果如圖5所示.由圖可見，在混合培養(yǎng)期間，隨著葡萄糖比例的不斷提高，小球藻的生物量開始有下降的過程，此后不斷上升.而含油量的多少會隨著葡萄糖的含量升高而升高.單一乙酸鈉為碳源時小球藻的含油量低于其他值，這說明乙酸鈉在同時間內(nèi)會比葡萄糖要晚被吸收利用.

圖5 葡萄糖與乙酸鈉的比例對小球藻生物量與油脂累積量的影響Fig.5 Effects of the proportion of glucose and sodium acetate glucose on the cell growth and oil accumulation of C.protothecoides

3 結(jié)論

葡萄糖和乙酸鈉對小球藻的油脂累積的具有較大影響.乙酸鈉作為碳源時，小球藻的生長量與含油量比葡萄糖作為碳源時要低.在乙酸鈉與葡萄糖混合培養(yǎng)條件下，葡萄糖被小球藻優(yōu)先吸收利用.在利用混合碳源培養(yǎng)時，小球藻可以實現(xiàn)碳源的梯級選擇性利用，實現(xiàn)糖類和小分子揮發(fā)酸的去除.

［1］王 萌，陳章和.藻類生物柴油研究現(xiàn)狀與展望［J］.生命科學(xué)，2011，23(1):121-126.

［2］鄭洪立，張 齊，馬小琛，等.產(chǎn)生物柴油微藻培養(yǎng)研究進展［J］.中國生物工程雜志，2009，29(3):110-116.

［3］Gill I，Valivety R.Polyunsaturated fatty acids，part 1:Occurrence，biological activities and applications［J］.Trends in Biotechnology，1997，15(10):401-409.

［4］Scott S A，Davey M P，Dennis J S，et al.Biodiesel from algae:challenges and prospects［J］.Current Opinion in Biotechnology，2010，21(3):1-10.

［5］Greenwell H C，Laurens L M L，Shields R J，et al.Placing microalgae on the biofuels priority list:a review of the technological challenges［J］.Journal of the Royal Society Interface，2010，7(46):703-726.

［6］韋志勇，黃寶祥，馮 偉，等.產(chǎn)油脂小球藻的篩選及其培養(yǎng)基的研究［J］.中國油脂，2011，36(8):37-40.

［7］Schwer B，Bunkenborg J，Verdin R，et al.Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103 (27):10224-102249.

［8］Jogl，G，Tong，L.Crystal structure of yeast acetyl-coenzyme A synthetase in complex with AMP［J］.Biochemistry，2004，43(6):1425-1431.