王桂秋

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高 發(fā)惡性腫瘤之一，生長(zhǎng)位置深，并有重要血管神經(jīng)相鄰，不易發(fā)現(xiàn)且不易手術(shù)切除［1-2］。臨床上多采用放射治療作為NPC首選治療方案，但因其具有中度敏感性、較高分化、預(yù)后差及易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，臨床上也多采用外科切除和藥物干預(yù)等方法進(jìn)行治療［3］。姜黃素(Curcumin，CU)是一種從姜黃根莖(Curcuma L.)中提取的活性成分，具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗發(fā)炎、降血脂［4］作用。其中，姜黃素抑制腫瘤的作用已由眾多實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，同時(shí)其抗癌機(jī)制已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［5-8］。本試驗(yàn)擬采用體外人鼻咽癌株 CNE-2Z細(xì)胞模型，探討CU對(duì)CNE-2Z中內(nèi)源性PI3K/Akt通路的影響，為闡明其對(duì)NPC的誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞 人鼻咽癌母系細(xì)胞株CNE-2Z細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑 姜黃素(純度＞96%):Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基:Gibco公司。小牛血清:Hyclone公司。胰蛋白酶:Sigma公司。0.25%胰酶:Gibco公司。8-羥基-2-脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)ELISA試劑盒:武漢博士德公司。甲基偶氮唑鹽(MTT):Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO):Sigma公司。熒光染料hoechest33342:Biotium公司。PI3K和Akt抗體:武漢博士德公司。蛋白裂解液:武漢博士德公司。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗、二抗:Sigma公司。

1.3 儀器 ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺(tái)(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)。IX71-A21PH倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。JC303A-T電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都一恒科技有限公司)。GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將胰酶用D-Hank's液配成0.05%的濃度，并置于37℃水浴中孵化。用10 mL含20%血清的培養(yǎng)液重懸CNE-2Z細(xì)胞，接種于60 cm2的培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中2 h后，取出，將未貼壁的細(xì)胞懸液取出，臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)后，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，接種到目的培養(yǎng)器皿中。接種后24 h，用溫的培養(yǎng)基輕輕沖洗培養(yǎng)的CNE-2Z細(xì)胞1次，除去未貼壁的細(xì)胞，再更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)孵化。

2.2 分組及給藥 孵化使細(xì)胞貼壁后，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的CU終濃度(0、20、40、80 μmol/L)，每孔 100 μL，同時(shí)設(shè)3個(gè)平行孔/組。重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，獲取平均值數(shù)據(jù)。應(yīng)用Graphpad Prism軟件計(jì)算IC50(半數(shù)抑制率)，即CU干預(yù) CNE-2Z細(xì)胞24、48 h后的 IC50值。同時(shí)增設(shè)對(duì)照組。

細(xì)胞增殖抑制率 =(OD對(duì)照-OD治療)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%

2.3 指標(biāo)檢測(cè) MTT法檢測(cè)其對(duì)CNE-2Z抑制增殖的作用，ELISA法檢測(cè)8-羥基-2-脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)水平，Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，Western blotting法檢測(cè)PI3K和Akt磷酸化水平。所有實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按照供應(yīng)商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CU干預(yù)對(duì)CNE-2Z細(xì)胞抑制作用 MTT法數(shù)據(jù)表明，梯度濃度的CU對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增加，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)提示，CU對(duì)CNE-2Z的干預(yù)有明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 梯度濃度的CU對(duì)CNE-2Z細(xì)胞抑制作用(n=10)

3.2 CU干預(yù)對(duì)CNE-2Z細(xì)胞8-OHdG水平的影響

ELISA結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，CU干預(yù)組CNE-2Z細(xì)胞中8-OHdG表達(dá)逐漸增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中，高劑量CU組表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)8-OHdG表達(dá)的效果，體現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。見(jiàn)圖1。

3.3 CU干預(yù)對(duì)CNE-2Z細(xì)胞凋亡形態(tài)變化的影響 Hoechst33342染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組中CNE-2Z的細(xì)胞核呈現(xiàn)為均勻彌散的淡藍(lán)色熒光，核飽滿(mǎn)，胞漿豐富。20 μg/mL濃度CU干預(yù)48 h后，開(kāi)始有部分CNE-2Z細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂，藍(lán)色熒光加強(qiáng)并出現(xiàn)細(xì)胞密度減少。40/80 μg/mL濃度CU干預(yù)后，CNE-2Z細(xì)胞分散，并造成核裂解和染色質(zhì)聚集，呈現(xiàn)致密較強(qiáng)藍(lán)色熒光，并伴隨著凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的增多。見(jiàn)圖2。

圖1 CU干預(yù)對(duì)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)源性8-OHdG表達(dá)的影響(±s，n=10)

圖2 CU干預(yù)對(duì)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響(Hoechst33342染色，×200)

3.4 CU干預(yù)對(duì)CNE-2Z細(xì)胞p-PI3K和p-Akt表達(dá)的影響 Western blotting分析表明，空白對(duì)照組中p-PI3K和p-Akt磷酸化程度較高，處于過(guò)激活狀態(tài)。經(jīng)CU干預(yù)48 h后，CNE-2Z細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt表達(dá)水平顯著下調(diào)，表現(xiàn)出一定的劑量和時(shí)間依賴(lài)性，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 CU干預(yù)對(duì)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)源性8-OHdG磷酸化水平的影響(±s，n=10)

4 討論

鼻咽癌是我國(guó)南方各省份地區(qū)常見(jiàn)的惡性腫瘤，在醫(yī)學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展的今天，其發(fā)病率卻一直居高不下。而且鼻咽癌易擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移，具有較高的隱蔽性，使得病情診斷存在一定的困難［9-10］。放射治療一直是鼻咽癌的基本治療方法。因鼻咽癌常有局部組織浸潤(rùn)或顱底骨質(zhì)破壞，手術(shù)常不能徹底清除病灶。早中期鼻咽癌的5年生存率平均在80%左右，而晚期僅為20% ～30%。因此，開(kāi)發(fā)有效的治療手段可以最大程度地降低患者的痛苦和社會(huì)的負(fù)擔(dān)，而中藥活性成分的發(fā)掘就成為抗癌治療的潛在策略［11］。在本研究中，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CNE-2Z細(xì)胞未受藥物干預(yù)時(shí)不受控制的增殖趨勢(shì)，提示抑制癌細(xì)胞的增殖可以有助于控制癌癥病情。CU干預(yù)有效地抑制了CNE-2Z的增殖，初步說(shuō)明CU具有抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖作用。細(xì)胞DNA發(fā)生損傷時(shí)，脫氧鳥(niǎo)苷C-8位點(diǎn)受氧化應(yīng)激作用8-羥基-脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)，造成體循環(huán)中8-OHdG濃度異常升高［12］。故檢測(cè)細(xì)胞群中的8-OHdG代謝水平，可以間接反映癌細(xì)胞增殖狀況。本實(shí)驗(yàn)中CU顯著增加8-OHdG的表達(dá)水平，提示CU抗細(xì)胞增殖作用與誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生氧化破壞 DNA雙鏈有關(guān)。同時(shí)，Hoechst33342染色觀察到，CU干預(yù)的CNE-2Z細(xì)胞明顯發(fā)生了細(xì)胞核病變，進(jìn)一步說(shuō)明了CU誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

有研究結(jié)果表明，PI3K/Akt通路活性介導(dǎo)下游靶基因/蛋白的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)一系列復(fù)雜的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控著細(xì)胞的增殖、分化、生長(zhǎng)和凋亡的病理生理過(guò)程［13-15］。此外，PI3K/Akt通路的激活與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16-17］，研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)PI3K與Akt的磷酸化活性，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，下調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞不斷地增殖和生長(zhǎng)［18-19］。因此，抑制癌細(xì)胞中的PI3K和Ak磷酸化水平是治療癌癥的積極策略［20-21］。本研究中，Western blotting結(jié)果表明，CNE-2Z細(xì)胞中 p-PI3K、p-Akt表達(dá)明顯增多，處于激活狀態(tài)。經(jīng)CU干預(yù)后，CNE-2Z細(xì)胞中高表達(dá)的PI3K和Akt磷酸化水平被有效抑制，提示抑制內(nèi)源性PI3K/Akt通路是CU抗腫瘤的作用機(jī)制之一。

綜上所述，姜黃素具有抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖的作用，將為其今后在臨床中的應(yīng)用提供有效的基礎(chǔ)理論依據(jù)。但姜黃素是否能有效合理地應(yīng)用于鼻咽癌患者的臨床治療還需要進(jìn)一步的研究。

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［1］Colaco RJ，Betts G，Donne A，et al.Nasopharyngeal carcinoma:a retrospective review of demographics，treatment and patient outcome in a single centre［J］.Clin Oncol(R Coll Radiol)，2013，25(3):171-177.

［2］范德生，李澤民，孫寧.姜黃素對(duì)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)癌癥雜志，2011，21(6):452-456.

［3］Liu H，Chen QY，Guo L，et al.Feasibility and efficacy of chemoradiotherapy for elderly patients with locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma:results from a matched cohort analysis［J］.Radiat Oncol，2013，8(1):70.

［4］鄭芳，鞏紅巖，秦元旭，等.姜黃素預(yù)處理對(duì)體外循環(huán)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)與抗氧化作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(5):148.

［5］范昊寧，佟麗，范欽.姜黃素對(duì)腫瘤的抑制和放射增敏作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(3):333.

［6］姚運(yùn)紅，余健華，熊暉.姜黃素體內(nèi)外對(duì)鼻咽癌的抗癌作用［J］.腫瘤防治研究，2006，33(7):487-489.

［7］滕達(dá)，王婷，劉軍權(quán).姜黃素對(duì)γδT細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用比較［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(20):3632-3634.

［8］梁統(tǒng)，陳美，周克元，等.姜黃素誘導(dǎo)低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z 的凋亡［J］.癌癥，2004，23(12):1651-1654.

［9］Li F，Song D，Lu Y，et al.Delayed-type hypersensitivity(DTH)immune response related with EBV-DNA in nasopharyngeal carcinoma treated with autologous dendritic cell vaccination after radiotherapy［J］.J Immunother，2013，36(3):208-214.

［10］陳冬平，齊斌，余意，等.鼻咽癌遠(yuǎn)期生存率及預(yù)后因素分析［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28(12):1999-2001.

［11］Smith ME，Bauer-Wu S.Traditional Chinese Medicine for cancer-related symptoms［J］.Semin Oncol Nurs，2012，28(1):64-74.

［12］Song MF，Li YS，Ootsuyama Y，et al.Urea，the most abundant component in urine，cross-reacts with a commercial 8-OH-dG ELISA kit and contributes to overestimation of urinary 8-OH-dG［J］.Free Radic Biol Med，2009，47(1):41-46.

［13］溫文勝，張哲，謝瑩，等.PI3K-Akt抑制劑誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞CNE2凋亡的作用［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，24(8):370-372.

［14］郭崇勇，柯衛(wèi)鋒，宋科瑛，等.PI3K/AKT通路參與調(diào)控乳腺癌多藥耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移的研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(25):4809-4812.

［15］Memmott RM，Dennis PA.Akt-dependent and-independent mechanisms of mTOR regulation in cancer［J］.Cell Signal，2009，21(5):656-664.

［16］陶冀，黎清煒，石學(xué)魁，等.紅花多糖抑制PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的研究［J］.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2012，26(2):119-124.

［17］韓艷艷，李芳.鼻咽癌組織中PI3K、mTOR的表達(dá)及臨床意義［J］.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2012，19(5):252-254.

［18］Fresno Vara JA，Casado E，De Castro J，et al.PI3K/Akt signalling pathway and cancer［J］.Cancer Treat Rev，2004，30(2):193-204.

［19］Carnero A，Blanco-Aparicio C，Renner O，et al.The PTEN/PI3K/AKT signalling pathway in cancer，therapeutic implications［J］.Curr Cancer Drug Targets，2008，8(3):187-198.

［20］張洪英，陳軍寶，盧宏柱.PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤血管形成中的作用研究進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥，2012，52(47):98-100.

［21］胡波，李燕，于晶宮，等.pI3K、P-Akt和PTEN在鼻咽癌中的表達(dá)及意義［J］.診斷病理學(xué)雜志，2009，16(6):459-461.