王 超，張 毅，何 平

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤及腫瘤導(dǎo)致死亡的首要原因［1］。目前，肺癌的治療方法主要包括化療、放療、手術(shù)治療等，但臨床療效不能令人滿意，因此，尋找對肺癌更有效的治療藥物尤為重要。近年來，已有多種中藥提取物應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療［2］。吉馬酮(Germacrone)是中藥姜科姜黃屬植物莪術(shù)根莖的化學(xué)成分，主要用于止咳、抗炎、平喘等治療［3］。近年來，國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮具有顯著的抗腫瘤作用，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［4-5］，但吉馬酮對肺癌的作用尚不明確。本實驗觀察吉馬酮對人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的影響，以期為肺癌的治療提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 人肺癌A549細(xì)胞由我院中心實驗室惠贈;吉馬酮:購自遼寧省藥品檢驗所;RPMI-1640培養(yǎng)基:購自美國Hyclone公司;胎牛血清:購自天津索萊寶生物工程有限公司;二甲基亞楓(DMSO):購自美國Sigma公司;0.25%胰蛋白酶:購自以色列Biological Industries公司;MTT及AnnexinV/PI雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;2.5%戊二醛、1.0%餓酸:中國醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供;流式細(xì)胞儀:美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、飽和濕度、5%二氧化碳條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將消化收集好的A549細(xì)胞調(diào)整成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板，實驗設(shè)3個平行孔。過夜貼壁后，依次加入不同濃度含吉馬酮的培養(yǎng)液，使其終濃度分別為 50、100、200、400 μmol/L，作用24 h。同時設(shè)空白對照組以及陰性對照組。每孔加MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加150 μL DMSO，振蕩混勻。酶標(biāo)儀檢測(波長570 nm)每孔光密度值(OD值)。實驗重復(fù)3次。增殖抑制率按如下公式計算:抑制率=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 將消化收集好的A549細(xì)胞制成濃度為5×105的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中培養(yǎng)。過夜貼壁后，依次加入不同濃度含吉馬酮的培養(yǎng)液，使其終濃度分別為0、100、400 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。以不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，離心、洗滌細(xì)胞。用500 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106/mL。AnnexinV-FITC、PI雙染細(xì)胞，避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。每組重復(fù)3次。

1.5 電子顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)變化 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，加入終濃度為400 μmol/L的吉馬酮溶液培養(yǎng)24 h，實驗同時設(shè)空白對照組。培養(yǎng)結(jié)束后消化收集細(xì)胞，用錐形離心管離心，棄上清，沉淀細(xì)胞先后應(yīng)用2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，逐級緩慢脫水，包埋，超薄切片，染色，透射電鏡下觀察并照相。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測吉馬酮對A549細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的吉馬酮作用于A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖水平明顯受到抑制。隨著藥物濃度的增大，吉馬酮對A549細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增加，呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05)(見圖1)。

圖1 吉馬酮對人肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法測吉馬酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，吉馬酮作用于A549細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增大，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(見圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測吉馬酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡

2.3 電子顯微鏡觀察A549細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化 電子顯微鏡下觀察到吉馬酮作用于A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，實驗組細(xì)胞可見染色質(zhì)濃聚、染色質(zhì)邊集等典型的凋亡改變，而對照組細(xì)胞無相應(yīng)變化(見圖3)。

3 討論

圖3 電子顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(4 000×)

吉馬酮是從莪術(shù)中提取的天然化合物。從莪術(shù)中分離的很多生物成分已被證明有抗腫瘤作用［6］，但對吉馬酮的研究較少。Liu 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮可以抑制肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞及Bel7402細(xì)胞的增殖，其機(jī)制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G2/M期及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時研究發(fā)現(xiàn)，同一濃度的吉馬酮對正常肝臟細(xì)胞系L02細(xì)胞的抑制作用不明顯，表現(xiàn)出高效低毒特點，是理想的抗腫瘤藥物篩選對象。Zhong等［5］研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮可以抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，其機(jī)制也與誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本實驗以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞為研究對象，MTT結(jié)果顯示，吉馬酮可抑制A549細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，吉馬酮可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。電子顯微鏡觀察到了細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變，進(jìn)一步證實了吉馬酮的抑制細(xì)胞增殖作用與可誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)。

綜上所述，吉馬酮對肺癌A549細(xì)胞的增殖有抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實驗結(jié)果為肺癌的治療提供了新思路，但尚需進(jìn)一步深入研究其抗腫瘤機(jī)制。

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［1］Cagle PT，Allen TC.Lung cancer genotype-based therapy and predictive biomarkers:present and future［J］.Arch Pathol Lab Med，2012，136(12):1482-1491.

［2］Kaefer CM，Milner JA.The role of herbs and spices in cancer prevention［J］.Nutr Biochem，2008，19(6):347-361.

［3］Claeson P，Panthong A，Tuchinda P，et al.Three non-phenolic diarylheptanoids with anti-inflammatoryactivity from Curcuma xanthorrhiza［J］.Planta Med，1993，59(5):451-454.

［4］Liu Y，Wang W，F(xiàn)ang B，et al.Anti-tumor effect of germacrone on human hepatoma cell lines through inducing G2/M cell cycle arrest and promoting apoptosis［J］.Eur J of Pharmacol，2013，698(1-3):95-102.

［5］Zhong Z，Chen X，Tan W，et al.Germacrone inhibits the proliferation of breast cancer cell lines by inducing cell cycle arrest and promoting apoptosis［J］.Euro J of Pharmacol，2011，667(1-3):50-55.

［6］Li Y，Wo JM，Liu Q，et al.Chemoprotective effects of Curcuma aromatica on esophageal carcinogenesis［J］.Ann Surg Oncol，2009，16(2):515-523.