徐福強，楊瑩，張曉東，葉麗虹，姚元慶

乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)是一種新發(fā)現(xiàn)的癌蛋白，由于它與乙肝病毒X蛋白結(jié)合而命名。研究發(fā)現(xiàn)HBXIP能與人體內(nèi)多種蛋白結(jié)合，參與細胞凋亡與增殖﹑細胞周期進程﹑中心體復(fù)制﹑腫瘤細胞遷移等過程[1-4]。HBXIP是一個多功能的調(diào)節(jié)蛋白，可通過調(diào)節(jié)不同的轉(zhuǎn)錄因子影響基因表達[5-6]。HBXIP還參與mTORC1信號通路和氨基酸代謝[7]。但目前尚未見卵巢癌中HBXIP表達的相關(guān)研究。Skp2是一種重要的細胞增殖周期調(diào)節(jié)因子[8]，在卵巢癌中高表達[9]，最新研究表明HBXIP可以通過Skp2途徑促進乳腺癌細胞的增殖[6]。本研究探討HBXIP基因?qū)β殉舶┘毎鲋彻δ艿挠绊?，以及可能的作用機制，旨在為HBXIP成為治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 真核表達載體與細胞株 真核表達載體pGL3-Basic，pCMV-Tag2B和pCMV-HBXIP由本室保存[10]。卵巢癌SKOV3細胞由南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院趙青博士惠贈。

1.1.2 引物設(shè)計 針對GenBank報道的Skp2啟動子的基因片段(NC-000005.9)設(shè)計引物，5'端添加限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切位點，3'端添加Xho Ⅰ酶切位點。引物序列如下：正義鏈，5'-CGGGGTACCCCG TCCCTTCTTTACACCAATCTC-3'；反義鏈，5'-CC GCTCGAGCGGCGTTTACCTGTGCATAGCG-3'。針對HBXIP的核酸序列(NM_006402)設(shè)計引物：正義鏈，5'-ATGGAGCCAGGTGCAGGTC-3'；反義鏈，

5'-TGGAGGGATTCTTCATTGTG-3'。GAPDH作為內(nèi)參，正義鏈，5'-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'；反義鏈，5'-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3'。引物由北京華大基因生物公司合成。

1.1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶﹑Taq DNA聚合酶﹑T4DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶均為寶生物(大連)生物工程有限公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；ECL Western blotting顯色試劑盒購自Amersham Biosciences公司；MTT試劑﹑β-actin單克隆抗體及HBXIP多克隆抗體購自Sigma公司；Skp2多克隆抗體購自Boster公司；雙熒光素酶測試試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細胞，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素，在37℃孵箱5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR 用Trizol法提取卵巢癌細胞系SKOV3的總RNA，通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，以此為模板進行PCR反應(yīng)，以超純水作為對照。取PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察結(jié)果并照相記錄。實驗均重復(fù)3次，Quantity One軟件分析電泳條帶灰度。

1.2.3 真核表達載體pGL3-Skp2啟動子的構(gòu)建構(gòu)建真核表達載體pGL3-Skp2啟動子，以卵巢癌SKOV3細胞基因組為模板，通過PCR方法擴增Skp2啟動子區(qū)域，酶切后嵌入表達載體pGL3-Basic。轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞Trans5α中，通過氨西林抗性篩選陽性克隆，然后進行載體酶切和序列測定。

1.2.4 瞬時轉(zhuǎn)染 真核表達載體pCMV-HBXIP質(zhì)粒由本室構(gòu)建[11]。將上述pCMV-HBXIP質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染SKOV3細胞作為實驗組，pCMV-Tag2B載體轉(zhuǎn)染SKOV3細胞為對照組，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofetamine 2000說明書，轉(zhuǎn)染前24h將細胞傳代，待細胞生長至60%～70%融合后進行轉(zhuǎn)染，6h后更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。

1.2.5 平板克隆 將pCMV-HBXIP和pCMV-Tag2B質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入卵巢癌細胞SKOV3，作為實驗組和對照組，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別計數(shù)后按每板500個細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板中。常規(guī)培養(yǎng)2周后行甲醇固定，亞甲基藍染色，鏡下計數(shù)細胞數(shù)多于50個的克隆數(shù)并照相記錄。

1.2.6 MTT分析 胰酶消化生長至對數(shù)期的卵巢癌細胞[12]，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，接種于96孔板，各孔細胞數(shù)約為1×103個。每組設(shè)6個平行孔，待細胞貼壁后分別轉(zhuǎn)染pCMV-HBXIP及pCMV-Tag2B質(zhì)粒，于37℃﹑5%CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在0﹑48h，加入20μl濃度為5g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入150ml DMSO，室溫振蕩10min，用酶標儀(波長570nm)測定各孔的吸光度(A)值。

1.2.7 熒光素酶報告基因分析 為研究HBXIP促進卵巢癌細胞增殖的機制，我們克隆了Skp2啟動子，并檢測HBXIP對Skp2啟動子活性的影響。將質(zhì)粒pRL-TK﹑pGL3-Skp2及pCMV-HBXIP(或pCMVTag2B)共轉(zhuǎn)染至SKOV3細胞中，以海腎熒光素酶表達載體pRL-TK為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48h后按照熒光素酶試劑盒說明測定光輸出值。每組實驗重復(fù)3次，以pCMV-Tag2B質(zhì)粒為對照。

1.2.8 Western blotting檢測 用預(yù)冷的PBS洗細胞2次，加入細胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl﹑pH8.0﹑1mmol/L EDTA﹑150mmol/L NaCl﹑1mmol/L PMSF﹑1% NP-40﹑1% SDS﹑蛋白酶抑制劑)冰上放置20min，4℃ 15 000r/min離心20min，收集上清行定量分析。取30～40μg總蛋白行12% SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入一抗，室溫培育3h，PBST洗膜，再分別加入抗鼠﹑抗兔的IgG室溫培育1h，PBST洗膜，應(yīng)用增強型ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影，實驗均重復(fù)3次，Quantity One軟件分析蛋白灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用Student's-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBXIP在卵巢癌細胞中的表達 PCR檢測結(jié)果顯示，對照組中未見GAPDH基因表達，與對照組相比，卵巢癌細胞SKOV3中可檢測到GAPDH表達(99.33±3.21)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。同時在卵巢癌細胞SKOV3中也檢測到HBXIP基因表達(100.33±4.73)，而對照組中亦未檢測到HBXIP基因的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，圖1)。

2.2 HBXIP對卵巢癌細胞增殖的作用 平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，與對照組(68.2±4.8)相比，實驗組卵巢細胞形成克隆的數(shù)目(117.0±9.1)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。采用MTT法分別檢測實驗組和對照組細胞的生存率，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48h后，實驗組卵巢癌細胞A值(0.287±0.030)顯著高于對照組(0.227±0.024)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 卵巢癌細胞中HBXIP基因的表達Fig.1 Expression of HBXIP gene in ovarian cancer cells

圖2 克隆形成數(shù)目比較Fig.2 Comparison of number of formed clones

2.3 HBXIP對Skp2啟動子活性的作用 熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示，與對照組(171.09±5.81)相比，實驗組Skp2啟動子活性(411.55±15.91)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 Western blott ing檢測Skp2蛋白表達 采用Western blotting檢測實驗組和對照組細胞中HBXIP和Skp2蛋白的表達水平，結(jié)果顯示，實驗組卵巢癌細胞中HBXIP蛋白的灰度值(156.67±5.51)高于對照組(141.33±3.37)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時Skp2蛋白的灰度值(216.52±9.54)也隨著HBXIP的過表達而升高，高于對照組中Skp2的表達(184.72±11.93)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 HBXIP和Skp2蛋白的表達Fig.3 Expression of HBXIP and Skp2 protein in respective group

3 討 論

HBXIP是一種細胞組成型表達蛋白，Melegari等[13]1998年首次于肝癌細胞株HepG2中克隆獲得HBXIP，作為乙肝病毒編碼的蛋白HBx的作用因子，并因此命名。HBXIP 基因定位于人染色體1p13.3，其開放閱讀框基因編碼全長173個氨基酸，分子量約為19kD。HBXIP與HBx的C末端結(jié)合后可下調(diào)HBx的活性，從而改變HBV的復(fù)制周期，同時抑制HBx對激活蛋白1(activating protein-1，AP-1)和內(nèi)源性HBV啟動子或增強子的反式激活作用，從而影響HBV的復(fù)制周期。研究發(fā)現(xiàn)HBXIP具有多種生物學(xué)功能，可與survivin和HBx形成復(fù)合物，并與pro-caspase-9結(jié)合，阻止其被凋亡酶激活因子Apaf-1招募，抑制線粒體或細胞色素C介導(dǎo)的凋亡途徑[1]。HBXIP可以通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白，調(diào)節(jié)hTERT的表達水平，調(diào)控NF-κB信號途徑而促進細胞增殖[2-4]。HBXIP還可以通過調(diào)節(jié)S100A4促進乳腺癌細胞的增殖和遷移[14]。這些結(jié)果提示HBXIP可通過多種途徑和機制促進腫瘤的增殖和遷移。

為進一步闡明HBXIP對卵巢癌細胞的影響，本研究對HBXIP促進卵巢癌細胞的增殖作用以及Skp2在其中的機制進行了探討。Skp2在多種惡性腫瘤中高表達，主要調(diào)節(jié)細胞從細胞周期的G1期進入到S期。Skp2的過表達促進了基因的復(fù)制和細胞增殖，與腫瘤的發(fā)生﹑浸潤﹑轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[15-17]。大量研究表明，Skp2的過表達與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)，Inuzuka等[18]發(fā)現(xiàn)Skp2在SKOV3等細胞中表達。Shigemasa等[9]發(fā)現(xiàn)Skp2的表達對卵巢癌的進展和發(fā)展具有重要意義，Skp2的過度表達可作為卵巢癌患者獨立的預(yù)后指標。Lu等[19]研究表明Skp2的表達水平與卵巢癌的臨床分期和病理分級顯著相關(guān)。最近研究表明，HBXIP可以結(jié)合Skp2啟動子中的轉(zhuǎn)錄因子E2F1，激活Skp2啟動子活性，同時上調(diào)Skp2的mRNA和蛋白表達，進而通過促進細胞周期進程來促進乳腺癌細胞的增殖[6]。但是，HBXIP在卵巢癌中是否也發(fā)揮同樣的作用，有待于更深入的研究。

本研究首先通過PCR實驗檢測到HBXIP基因在卵巢癌細胞中表達，再通過平板克隆形成實驗檢測了卵巢癌SKOV3細胞的增殖能力，結(jié)果表明HBXIP可以促進卵巢癌細胞的增殖，并經(jīng)MTT實驗結(jié)果確認。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，HBXIP的過表達具有促進Skp2啟動子活性的作用。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pCMV-HBXIP的卵巢癌細胞SKOV3中，HBXIP蛋白表達水平上升，表明pCMVHBXIP成功轉(zhuǎn)染并表達，同時Skp2的蛋白水平也隨著HBXIP的轉(zhuǎn)染水平上升。提示卵巢癌中HBXIP可以激活Skp2啟動子的活性，進而促進Skp2蛋白的表達。這與之前的研究結(jié)果相符合[6]，上述結(jié)果提示HBXIP可提高Skp2啟動子活性和蛋白表達，進而通過Skp2發(fā)揮促進卵巢癌細胞增殖的作用。

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