陳瑞，張磊，宋少華，鄒游，倪之嘉，郭聞淵

如何誘導宿主對移植物的免疫耐受一直是器官移植后的難題。最近研究表明，調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)作為T細胞的一個亞類，在免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，如果Treg細胞功能發(fā)生紊亂，就可能導致自身免疫性疾病和免疫排斥[1]。血紅素加氧酶-1(heme oxygenases-1，HO-1)是血紅素分解的限速酶，通過抗炎﹑抗凋亡﹑抗增殖等在多種疾病中發(fā)揮作用[2]。有研究表明HO-1在器官移植中是一種保護性基因，移植后可發(fā)揮免疫耐受作用[3]，但機制尚不明確。本研究探討了HO-1對淋巴細胞向CD4+CD25+Treg分化的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 清潔級C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重15～20g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。HO-1誘導劑鈷原卟啉(Copp)﹑HO-1抑制劑鋅原卟啉(Znpp)﹑二甲基亞砜(DMSO)﹑刀豆素A(ConA)﹑聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分離液購于Sigma公司，RPMI 1640﹑胎牛血清購于Gibco公司，抗小鼠CD25-FITC和CD4-PE流式熒光抗體購于Ebioscience公司，ELISA試劑盒購于BD公司，Western blotting試劑盒購于碧云天公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟淋巴細胞制備 無菌條件下取出C57BL/6小鼠脾臟，取70μm細胞濾網(wǎng)置于6cm培養(yǎng)皿中央，加入適量PBS溶液，將脾臟置于細胞濾網(wǎng)中，用2ml注射器針芯研磨，并以2ml或5ml注射器抽吸吹打成單細胞懸液，調(diào)整體積至6ml或8ml。取3ml或4ml分離液置于離心管中，將上述脾臟細胞懸液緩慢加于分離液上，形成清晰界面。細胞懸液與分層液的體積比以2:1～3:1為宜。將離心管置于水平離心機中，2000r/min﹑20℃離心20min，將加減速均調(diào)整為0。離心后從離心管底部到液面共分為4層，依次為紅細胞和粒細胞層﹑分層液層﹑單個核細胞層﹑血漿層(含血小板和破碎細胞)。小心吸出界面處白膜層單個核細胞，置于另一離心管中，加入5倍量以上PBS液，充分混勻，1300r/min離心6min。棄上清，重復洗滌兩遍，重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞密度為1×107/ml，37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測淋巴細胞HO-1和Foxp3 mRNA表達 收集離心重懸后細胞，按1×106/ml接種至6孔板，分為3組，即PBS組﹑Copp組和Znpp組，分別加入10μl PBS﹑Copp(50μmol/L)﹑Znpp(50μmol/L)處理12h，采用Trizol法提取細胞總mRNA，進行反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR反應(yīng)，引物由上海生工生物有限公司合成。使用QuantityOne軟件進行定量分析，以GAPDH作為內(nèi)參，計算HO-1和Foxp3的相對表達量。

1.2.3 Western blotting檢測HO-1蛋白的表達 收集上述3組細胞，提取總蛋白。各取50μg總蛋白樣品，行SDS-PAGE凝膠電泳(300mA，60min)，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫下封閉2h，加入HO-1一抗(1:1000)和內(nèi)參β-tubulin抗體(1:3000)過夜，加入二抗(1:1000)室溫孵育2h，ECL發(fā)光。采用QuantityOne軟件行定量分析。

1.2.4 流式細胞儀檢測CD4+/CD25+T細胞比例收集各組小鼠脾臟淋巴細胞，用ConA孵育48h，調(diào)整每管細胞數(shù)為2×105個；分別加入抗小鼠CD25+-FITC熒光抗體﹑抗小鼠CD4+-PE熒光抗體及相應(yīng)同型對照；冰上孵育30min，加入2% FBS-PBS液洗滌去除未結(jié)合抗體，1300r/min離心6min，洗兩次；將細胞重懸至200μl，采用BD LSRⅡ流式細胞儀檢測。

1.2.5 Th1﹑Th2類細胞因子表達的ELISA檢測 收集各組細胞上清，采用ELISA法檢測Th1類細胞因子IL-2和IFN-γ﹑Th2類細胞因子IL-10和TGF-β的表達水平。操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SAS 9.13軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 淋巴細胞HO-1 mRNA和蛋白表達情況 與PBS組比較，加入Copp誘導劑后，HO-1 mRNA和蛋白表達水平明顯增加，而加入Znpp后，HO-1mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05，圖1)。

2.2 流式細胞儀檢測淋巴細胞向CD4+CD25+T細胞分化比例 與PBS組(3.5%)比較，Copp組向CD4+CD25+T細胞分化的比例(13.5%)明顯增高(P＜0.05)，Znpp組(2.5%)則有所下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

2.3 Foxp3 mRNA表達檢測 由圖3可見，與PBS組相比，Znpp組Foxp3 mRNA表達下降，Copp組Foxp3mRNA表達增加(P＜0.05)。由于Foxp3是Treg的特異性標記[4]，所以可以確定上述CD4+CD25+T細胞是CD4+CD25+Treg細胞，提示HO-1可以促進T淋巴細胞向CD4+CD25+Treg的分化。

2.4 Th1/Th2類細胞因子表達的ELISA檢測結(jié)果與PBS組比較，Copp組Th1類細胞因子IL-2和IFN-γ表達水平明顯降低(P＜0.05)，Th2類細胞因子IL-10和TGF-β表達水平明顯升高(P＜0.05)。與之相反，Znpp組的Th1類細胞因子表達水平明顯上升，Th2類細胞因子表達水平明顯降低(圖4，P＜0.05)。

3 討 論

HO-1是血紅素分解的限速酶，具有抗炎﹑抗凋亡﹑抗增殖等作用[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)HO-1是一種保護性基因，在自身免疫性疾病﹑器官移植中有抑制免疫反應(yīng)的作用，可減輕移植后的慢性排斥反應(yīng)，延長移植物生存時間[3]。有研究表明，在肝移植術(shù)后，HO-1可以減輕缺血再灌注損傷及移植物的免疫排斥反應(yīng)，但這種保護作用尤其是在免疫耐受方面的作用機制仍然不明確[6-7]。在炎癥性疾病中HO-1可通過促進巨噬細胞高表達Th2類細胞因子IL-10來發(fā)揮抗炎作用[8]，而IL-10是參與免疫耐受的重要的細胞因子。因此推測HO-1可能會通過調(diào)節(jié)Th1和Th2類細胞因子的平衡來發(fā)揮免疫耐受作用。

圖1 HO-1 mRNA(A)和蛋白(B)表達情況Fig.1 HO-1 mRNA (A) and protein (B) expression

圖2 各組細胞誘導分化為CD4+CD25+T細胞的比例Fig.2 The ratio of differentiated CD4+CD25+ T cells in each group

圖3 各組細胞Foxp3 mRNA表達情況Fig.3 Foxp3 mRNA expression in each group

圖4 細胞因子IL-2﹑IFN-γ﹑TGF-β﹑IL-10表達的ELISA檢測結(jié)果Fig.4 Expression of IL-2, IFN-γ, TGF-β and IL-10 detected by ELISA

CD4+CD25+T細胞是CD4+T細胞的一個亞類，此細胞群高表達CD25+﹑CD4+和Foxp3。Foxp3是Treg分化和發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子，被認為是Treg的特異性標記[9]。盡管Treg在T淋巴細胞中所占比例不大，但可抑制T細胞的自身免疫性反應(yīng)，減輕由于后者引起的炎癥性疾病，在免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用[10-11]。研究顯示，Treg可抑制細胞因子IL-2的表達，從而阻斷免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生[12]。IL-10和TGF-β等抑炎細胞因子可誘導CD4+CD25+Treg的生成[13]。Th1和Th2細胞因子是兩種參與不同免疫反應(yīng)類型的細胞因子，Th1細胞因子IL-2和IFN-γ是促炎因子，可以促進免疫反應(yīng)的發(fā)生，Th2類細胞因子IL-10和TGF-β是抑炎因子，主要在免疫耐受中起作用[14]。兩種細胞因子互相平衡共同調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，否則就會導致免疫功能的紊亂。自身免疫疾病和炎癥反應(yīng)使Th 1類細胞因子IL-2﹑IFN-γ表達增加，而Th2類細胞因子IL-10和TGF-β可以下調(diào)Th 1類細胞因子的表達[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，HO-1表達增加的細胞高表達Th2細胞因子，而低表達Th1類細胞因子，從而誘導小鼠脾臟淋巴細胞高表達Foxp3并向CD4+CD25+Treg分化，提示在器官移植中HO-1可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡誘導CD4+CD25+Treg的分化，從而發(fā)揮免疫耐受作用。

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