金明姬，黃偉，陳衛(wèi)，高鐘鎬

肝纖維化是威脅人類健康的常見病變，是各種慢性肝病最重要的病理特征，能夠引發(fā)肝硬化，也是誘發(fā)原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)因素之一[1]。肝纖維化可導(dǎo)致正常肝組織的結(jié)構(gòu)及功能改變[2-3]，其中25%～40%的患者可能發(fā)展為肝硬化乃至肝癌。選擇適當(dāng)?shù)母卫w維化動(dòng)物模型是深入研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)，也是篩選防治肝纖維化藥物的有效手段。凱時(shí)注射液是一種用脂微球包裹前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)的新型載體制劑，在臨床上主要用于治療慢性動(dòng)脈閉塞癥引起的四肢潰瘍及四肢靜息疼痛，并能改善心腦血管微循環(huán)障礙，因此也用于臟器移植術(shù)后抗栓治療和小兒先天性心臟病動(dòng)脈導(dǎo)管未閉等。筆者推測(cè)，凱時(shí)注射液很可能對(duì)肝纖維化具有一定治療作用，而新型微球制劑可能使其發(fā)揮更好的效果。因此，本研究首先選用3種不同藥物二甲基亞硝胺(DMN)﹑硫代乙酰胺(TAA)和四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)[4]建立肝纖維化模型，比較篩選出一種最佳模型，再使用該模型評(píng)價(jià)凱時(shí)注射液的抗肝纖維化作用，為凱時(shí)注射液對(duì)肝纖維化疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 DMN﹑TAA和CCl4購自Sigma公司，市售橄欖油，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)﹑天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)及透明質(zhì)酸(HA)檢測(cè)試劑盒購自南京建成科技有限公司，凱時(shí)注射液購自北京泰德制藥有限公司，其他試劑均為分析純。AL204型電子天平購自METTLER TOLEDO公司；高速離心機(jī)購自Thermo公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀購自澳大利亞TECAN公司；TU1900紫外分光光度計(jì)購自上海棱譜儀器有限公司。

1.2 動(dòng)物模型建立與分組 BALB/c小鼠40只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，雌雄各半，體重15g左右，隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組﹑DMN組﹑TAA組﹑CCl4組。DMN和TAA用生理鹽水配制，給藥劑量分別為10μl/kg和200mg/kg；CCl4用橄欖油稀釋4倍，給藥劑量為0.1ml/kg；空白對(duì)照組注射生理鹽水，劑量為15ml/kg。各組小鼠均采用腹腔注射給藥，次數(shù)為3次/周，連續(xù)給藥5周后觀察腹腔腹水情況及小鼠生存情況。

1.3 肝組織病理學(xué)檢查 各組小鼠連續(xù)給藥5周后眼眶取血，脫臼處死，采集肝臟組織，迅速用10%中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片。對(duì)肝臟組織切片進(jìn)行HE及Masson常規(guī)染色，光鏡下觀察組織病理形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化。根據(jù)肝損傷程度﹑肝組織纖維化程度和肝膽管上皮細(xì)胞增生程度對(duì)各組進(jìn)行計(jì)分﹑比較。其中纖維化程度評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)如下[5]：“－”無成纖維細(xì)胞增生，計(jì)0分；“+”匯管區(qū)擴(kuò)大，有少量成纖維細(xì)胞增生，計(jì)1分；“匯管區(qū)成纖維細(xì)胞增生”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞增生并向小葉內(nèi)延伸，呈較窄較短的纖維素條，計(jì)2分；“”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞大量增生并向小葉內(nèi)明顯延伸，形成纖維隔伴有小葉結(jié)構(gòu)紊亂，計(jì)3分。最后以肉眼觀察到肝纖維化形成及鏡下纖維組織增生形成作為肝纖維化模型誘導(dǎo)成功的標(biāo)志[6]。

1.4 血清ALT﹑AST及HA含量的測(cè)定 各組小鼠給藥5周后眼眶取血，血液加入含0.38%枸櫞酸鈉的試管中，離心取上清，按照各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)試劑盒中的規(guī)定測(cè)定血清中ALT﹑AST及HA的含量。

1.5 用凱時(shí)注射液治療DMN誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠 30只BALB/c小鼠，雌雄各半，體重15g左右，隨機(jī)分均為3組，分別為空白對(duì)照組﹑模型組﹑治療組。首先建立病理模型，空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水15ml/kg，模型組和治療組分別腹腔注射DMN 10μl/kg，3次/周，連續(xù)給藥5周后，空白對(duì)照組和模型組分別靜脈注射生理鹽水，治療組靜脈注射凱時(shí)注射液，6ml/(kg.d)。連續(xù)給藥20d后，按照1.3和1.4的方法進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般生長(zhǎng)情況 實(shí)驗(yàn)期間各實(shí)驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)活動(dòng)減少﹑精神萎靡﹑對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍的現(xiàn)象，其中DMN組小鼠死亡2只，TAA組小鼠死亡1只，其他兩組均未發(fā)生死亡。各組小鼠體重變化及死亡情況見表1。

表1 各組小鼠體重變化及死亡情況(±s, n=10)Tab.1 The body weight and death of experimental mice(±s, n=10)

表1 各組小鼠體重變化及死亡情況(±s, n=10)Tab.1 The body weight and death of experimental mice(±s, n=10)

(1)P＜0.05 compared with control group

Group Dose Gain weight (g) Mortality (case)Control group 15ml/kg 22.45±3.45 0 DMN group 10μl/kg 16.29±2.17(1) 2 TAA group 200mg/kg 20.34±3.04 1 CCl4 group 100μl/kg 15.53±2.55(1) 0

2.2 肝組織病理學(xué)檢查 空白對(duì)照組HE染色后見肝小葉肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞無變性壞死，肝竇未見明顯異常，Masson染色示肝臟門脈區(qū)和肝竇網(wǎng)狀纖維呈淺綠色，肝組織間未見明顯纖維增生。DMN組HE染色見肝組織形成假小葉，周圍出血，纖維組織增生并出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)，Masson染色同樣見肝組織內(nèi)假小葉形成，纖維組織明顯增生形成包膜，肝細(xì)胞索纖維分割，周圍廣泛出血。TAA組HE染色見肝小葉肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞無變性壞死，未見明顯纖維增生和纖維化，Masson染色見肝小葉中央靜脈網(wǎng)狀纖維著色淺綠，肝組織間未見明顯纖維增生。CCl4組HE染色見個(gè)別肝細(xì)胞有變性和壞死，其他未見異常，Masson染色見輕度肝竇網(wǎng)狀纖維腫脹，輕度纖維組織增生。以上結(jié)果表明DMN誘導(dǎo)的小鼠最具備典型的肝纖維化表現(xiàn)，模型建立成功，其他兩組的肝纖維化特征并不是很明顯，與DMN組相比，具有一定的差異(圖1)。

2.3 各組小鼠肝纖維化程度比較 按照肝纖維化分級(jí)方法對(duì)4個(gè)組進(jìn)行了評(píng)分﹑比較，DMN誘導(dǎo)的小鼠形成典型的肝纖維化模型，其他兩組的增生﹑變性﹑壞死及細(xì)胞組織的特征性變化不明顯。與空白對(duì)照組相比，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)顯著肝纖維化(P＜0.05)；與TAA組和CCl4組相比，DMN組的纖維化程度更為明顯(P＜0.05，表2﹑3)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化(×100)Fig.1 Histopathological changes of the mouse liver tissue of the different groups (×100)

2.4 各組小鼠血清ALT﹑AST及HA含量測(cè)定結(jié)果與空白對(duì)照組相比，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的血清ALT﹑AST及HA含量均有明顯上升(P＜0.05)；而與TAA組和CCl4組相比，DMN組的ALT﹑AST及HA含量上升更為明顯(P＜0.05)；TAA組和CCl4組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

2.5 凱時(shí)注射液治療DMN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)過程中，模型組和治療組各有1只動(dòng)物死亡，肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示治療組肝細(xì)胞變性﹑壞死﹑出血和纖維化程度明顯輕于DMN模型組(圖2)。與模型組比較，治療組肝損傷﹑肝組織纖維化和肝膽管上皮細(xì)胞增生均有明顯減輕(P＜0.05，表5)。各組小鼠血清ALT﹑AST及HA含量，與空白對(duì)照組相比，模型組和治療組血清ALT﹑AST及HA含量均明顯上升(P＜0.001)；與模型組相比，治療組ALT﹑AST及HA含量有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表6)。

表2 各組肝臟組織病理學(xué)病變發(fā)生情況(n=10)Tab.2 The liver histopathologic lesions of each group (n=10)

表3 各組肝損傷﹑肝組織纖維化和肝膽管上皮細(xì)胞增生計(jì)分情況(±s, n=10)Tab. 3 Scores of liver injury, fibrosis and hepatic duct epithelial hyperplasia (±s, n=10)

表3 各組肝損傷﹑肝組織纖維化和肝膽管上皮細(xì)胞增生計(jì)分情況(±s, n=10)Tab. 3 Scores of liver injury, fibrosis and hepatic duct epithelial hyperplasia (±s, n=10)

(1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with DMN group

Group Liver injury score Liver tissue fibrosis score Bile duct hyperplasia score Control group 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 DMN group 2.57±0.54(1) 1.71±0.38(1) 1.71±0.95(1)TAA group 1.67±0.41(1)(2) 0.33±0.81(1)(2) 0.83±0.75(1)(2)CCl4 group 0.86±0.38(1)(2) 0.14±0.38(1)(2) 0.00±0.00(1)(2)

3 討 論

肝纖維化動(dòng)物模型是深入研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)，同樣，進(jìn)行藥物抗肝纖維化的研究也必須建立合適的動(dòng)物模型。理想的肝纖維化動(dòng)物模型應(yīng)符合

如下條件[7]：①與人類肝纖維化疾病的基本病變特征相似；②病變有一定發(fā)展過程，病程發(fā)展存在一個(gè)可逆與不可逆的階段性演進(jìn)過程；③形成率高，病死率低，重復(fù)性好；④方法簡(jiǎn)便易行；⑤動(dòng)物易獲得，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。目前常用的各種造模方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，可以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的造模方式。本研究分別采用3種藥物建立不同的小鼠肝纖維化模型，并通過一系列評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行最優(yōu)模型的篩選。DMN具有肝毒性﹑基因毒性和免疫毒性，其活性代謝產(chǎn)物使核酸﹑蛋白質(zhì)等重要的生命物質(zhì)發(fā)生甲基化，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，并可使細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性增多[8-9]。CCl4是一種經(jīng)典的誘發(fā)肝纖維化的選擇性肝毒性藥物[10]，可引起肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，從而損傷肝細(xì)胞[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中，與CCl4模型相比，DMN模型中肝細(xì)胞無脂肪變性，肝纖維化形成相對(duì)穩(wěn)定，模型成功率高，纖維化程度比較接近臨床患者的實(shí)際情況。CCl4的肝纖維化模型在中斷藥物后有一定的自愈傾向，而DMN模型在中斷藥物后數(shù)月內(nèi)還能保持較穩(wěn)定的進(jìn)展[13-14]。TAA與DMN的作用機(jī)制相似，都是通過影響蛋白質(zhì)合成及肝細(xì)胞中酶的代謝誘導(dǎo)肝損傷[15]，中斷給藥后肝纖維化仍能保持一定的時(shí)間。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出，TAA及CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的成功率并不是很高，雖然跟正常對(duì)照組相比過半小鼠出現(xiàn)了肝纖維化，但是與DMN相比肝纖維化模型形成程度沒有達(dá)到規(guī)定的要求，其成功率也較低。TAA組和CCl4組的小鼠肝損傷模型制備誘發(fā)病變程度較輕，多數(shù)動(dòng)物未出現(xiàn)肝損傷病變和肝纖維化，未達(dá)到制備肝損傷和肝纖維化模型的預(yù)期結(jié)果。DMN誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中形成的肝纖維化，與臨床病理特征相似，并且病理切片結(jié)果也很好地證明了其肝纖維化特征。但DMN組也存在一定的缺點(diǎn)，該組死亡率比其他組略高，可能與DMN毒性較大有關(guān)[14]，因此在實(shí)驗(yàn)中用DMN制備動(dòng)物模型時(shí)一定要控制好給藥劑量，時(shí)刻觀察動(dòng)物的狀態(tài)，以降低死亡率。

表4 各組小鼠血清ALT﹑AST及HA含量的變化(±s, n=10)Tab. 4 Serous levels of ALT, AST and HA (±s, n=10)

表4 各組小鼠血清ALT﹑AST及HA含量的變化(±s, n=10)Tab. 4 Serous levels of ALT, AST and HA (±s, n=10)

(1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with DMN group

Group ALT(U/L) AST(U/L) HA(μg/L)Control group 29.8±6.5 38.4±8.9 189.2±20.8 DMN group 417.3±37.0(1) 402.3±53.0(1) 310.6±33.7(1)TAA group 265.8±30.6(1)(2) 289.1±40.4(1)(2) 208.5±32.4(1)(2)CCl4 group 272.1±26.4(1)(2) 252.8±48.2(1)(2) 225.8±40.5(1)(2)

表5 凱時(shí)注射液對(duì)DMN誘導(dǎo)肝纖維化模型小鼠肝損傷﹑肝組織纖維化和肝膽管上皮細(xì)胞增生的影響(±s, n=10)Tab. 5 Effects of Kaishi on liver injury, fibrosis and hepatic duct epithelial hyperplasia of mice (±s, n=10)

表5 凱時(shí)注射液對(duì)DMN誘導(dǎo)肝纖維化模型小鼠肝損傷﹑肝組織纖維化和肝膽管上皮細(xì)胞增生的影響(±s, n=10)Tab. 5 Effects of Kaishi on liver injury, fibrosis and hepatic duct epithelial hyperplasia of mice (±s, n=10)

(1)P＜0.001 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with DMN group

Group Liver injury score Liver tissue fibrosis score Bile duct hyperplasia score Control group 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 DMN group 2.11±0.38(1) 0.89±0.41(1) 1.25±0.33(1)Kaishi injection group 1.79±0.41(1)(2) 0.68±0.27(1)(2) 1.01±0.25(1)(2)

表6 凱時(shí)注射液對(duì)DMN誘導(dǎo)肝纖維化模型小鼠血清ALT﹑AST及HA含量的影響(±s, n=10)Tab. 6 Effects of Kaishi on ALT, AST and HA in DMN induced mice liver fibrosis (±s, n=10)

表6 凱時(shí)注射液對(duì)DMN誘導(dǎo)肝纖維化模型小鼠血清ALT﹑AST及HA含量的影響(±s, n=10)Tab. 6 Effects of Kaishi on ALT, AST and HA in DMN induced mice liver fibrosis (±s, n=10)

(1)P＜0.001 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with DMN group

Group ALT(U/L) AST(U/L) HA(μg/L)Control group 19.15±3.84 28.34±5.26 86.58±15.24 DMN group 256.24±41.08(1) 295.14±33.25(1) 243.52±25.24(1)Kaishi injection group 189.92±25.44(1)(2) 251.64±22.59(1)(2) 210.15±25.20(1)(2)

PGE1作用于血管PGE1受體，能夠擴(kuò)張血管，增加門靜脈血流量，并且能夠調(diào)節(jié)前列環(huán)素與血栓素A的平衡，改善肝臟微循環(huán)，從而增加肝組織供氧量，消除肝細(xì)胞代謝產(chǎn)物[16]。凱時(shí)注射液是PGE1包裹在脂微球中的一種新型載體制劑[17]，不易在肺內(nèi)失活，體內(nèi)作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且脂微球極易集聚在炎癥病灶和病變血管處，有靶向作用，因此僅用原PGE1制劑的1/5～1/10的量即可取得相同療效且副作用小，多用于肝炎及肝纖維化的治療[18-19]。目前認(rèn)為，凱時(shí)注射液用于肝疾病的治療，可能通過改善肝臟微循環(huán)﹑減少血小板衍生生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子及內(nèi)毒素水平等，減輕肝臟炎癥，促進(jìn)肝細(xì)胞再生及肝功能的恢復(fù)，并減少肝臟星狀細(xì)胞的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而起到抗肝纖維化作用[20]。肝損傷﹑肝纖維化后，血清中多種酶如ALT﹑AST和相應(yīng)物質(zhì)含量發(fā)生改變且與肝損傷﹑肝纖維化的程度呈正相關(guān)，可作為輔助診斷指標(biāo)。HA主要被肝內(nèi)皮細(xì)胞分解攝取，當(dāng)肝內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，HA因攝取不足而顯著升高。HA的增高也表明肝星狀細(xì)胞較活躍，細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，這些都是肝纖維化形成的標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，凱時(shí)注射液治療后肝組織纖維化程度﹑肝損傷以及血清中ALT﹑AST﹑HA含量均有所下降(P＜0.05)。肝組織病理結(jié)果顯示，凱時(shí)注射液可減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，抑制肝膽管上皮細(xì)胞的增生，進(jìn)一步證實(shí)凱時(shí)注射液具有抗炎﹑抗肝纖維化的作用。但是，凱時(shí)注射液改善炎癥反應(yīng)和纖維化程度，以及降低血清中ALT﹑AST﹑HA含量的機(jī)制尚未完全闡明，可能與改善肝臟微循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制血小板產(chǎn)生和聚集，減少炎癥因子對(duì)肝星狀細(xì)胞的刺激，減少肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生等有關(guān)[17]。

本研究結(jié)果表明，不同類型藥物誘導(dǎo)的肝纖維化程度及標(biāo)準(zhǔn)不同，應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的動(dòng)物模型。凱時(shí)注射液具有改善肝炎及肝纖維化的功效，并能降低血清中ALT﹑AST及HA的含量，這將為凱時(shí)注射液和PGE1用于肝炎和肝纖維化的治療提供重要的參考依據(jù)。

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