劉 琪，潘翠翠，徐 新，張彥懿，吳小候，羅春麗*

(重慶醫(yī)科大學1.檢驗醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室重慶市重點實驗室;2.附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶400016)

腫瘤發(fā)生的分子機制主要有3種類型:基因突變、基因缺失和表觀遺傳學改變［1］。而表觀遺傳學改變又主要包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化和組蛋白甲基化［2］。其中DNA甲基化改變分為全基因組水平的低甲基化和 CpG島 DNA高甲基化［3］;CpG島的異常高甲基化主要發(fā)生于抑癌基因啟動子區(qū)域。故抑癌基因在腫瘤中的失活可歸結(jié)于其基因啟動子區(qū)域CpG島的異常高甲基化。

DNA甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化形成，是在不改變核酸序列的情況下，調(diào)節(jié)基因表達的不可逆過程［4］。5-氮-2'脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-CdR)是DNMT的抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化，使其重新表達［5］。在很多其他腫瘤研究中，例如結(jié)腸癌［6］、前列腺癌［7］等，5-aza-CdR都可在一定程度上逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化并抑制腫瘤生長。肝細胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule，hepaCAM)，作為一個抑癌基因，在膀胱癌中表達低下，并且在體外研究中發(fā)現(xiàn)hepaCAM具有抑制膀胱癌生長的作用［8－9］。因此，本研究以hepaCAM為出發(fā)點，探究5-aza-CdR是否也能逆轉(zhuǎn)hepaCAM基因在膀胱癌細胞中的表達，并與hepaCAM一起發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌細胞T24(重慶醫(yī)科大學傳染病研究所惠贈)，BIU-87細胞系(武漢大學細胞庫)。5-aza-CdR、MTT試劑和二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司);RNA提取試劑盒Trizol和RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程);PCR引物(Invitrogen公司);細胞培養(yǎng)基RPMI1640和新生牛血清(Gibco公司);細胞凋亡檢測試劑(重慶醫(yī)科大學兒研所流式細胞實驗室提供)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):T24和BIU-87細胞培養(yǎng)于含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。將細胞以1×106個/孔的密度種于6孔板中，待細胞生長匯合度達到80%～90%，按照總 RNA提取步驟提取 RNA，保存于－80℃，為后續(xù)實驗準備。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測5-aza-CdR對T24和BIU-87細胞增殖的影響:取對數(shù)期生長的T24和BIU-87細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×104個/mL，接種于96孔板中，最后補充培養(yǎng)基至200 μL。每組設(shè)5個復孔，同時接種3個96孔板，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗分為6組:T24(調(diào)零組、未處理組、0.3、1.0、3.0 和10.0 μmol/L)，BIU-87(調(diào)零組、未處理組、0.1、0.5、1.0 和5.0 μmol/L)。加藥后3個板分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。棄上清，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去上清，加入 DMSO 200 μL，振蕩孵育15 min，全自動酶標儀(570 nm)檢測各孔的吸光度(A值)。計算各組細胞生長抑制率，公式如下:抑制率(%)=［1－(A處理－A調(diào)零)/(A對照－A調(diào)零)］ ×100%。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測hepaCAM mRNA的表達:分別用不同濃度的5-aza-CdR處理T24和BIU-87細胞，未用藥物處理作為對照，培養(yǎng)24、48和72 h后收集細胞，提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，RT-PCR檢測5-aza-CdR處理前后T24和BIU-87細胞中hepaCAM表達的變化。PCR反應(yīng)條件:hepaCAM:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min共35個循環(huán);72℃繼續(xù)延伸5 min。β-actin:95℃預(yù)變性5 min;94℃ 變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30個循環(huán);72℃繼續(xù)延伸5 min。hepaCAM上游引物是5'-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3'，下游引物是5'-CTTCTGGTTTCAGGCGGTC-3'，擴增產(chǎn)物為461 bp。β-actin上游引物是5'-ACGAGACCACCT TCAACTCCATC-3'，下游引物是5'-TAGAAGCATTTG CGGTGGACGA-3'，擴增產(chǎn)物片斷為307 bp。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:收集細胞，固定于70%冷乙醇(in PBS)中，4℃固定過夜，磷酸二氫鹽緩沖液(PBS)洗滌，1 000 r/min離心10 min，RNase A(0.5 g/L)37℃ 消化30 min，加入 PI(50 g/L)染色，室溫避光15 min，F(xiàn)ACScan分析DNA亞2倍體的形成及細胞凋亡的變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測5-aza-CdR對T24和BIU-87細胞增殖的影響

5-aza-CdR呈劑量依賴性抑制了T24與BIU-87細胞的增殖。在T24與BIU-87細胞中，藥物處理細胞72 h的抑制率明顯高于24和48 h(P＜0.05)(圖1)。

2.2 RT-PCR檢測5-aza-CdR處理T24和BIU-87細胞后hepaCAM mRNA的表達

經(jīng)5-aza-CdR處理T24和BIU-87細胞后，hepaCAM表達呈劑量依賴性和時間依賴性 (圖2，表1，2)。

2.3 流式細胞術(shù)檢測5-aza-CdR對T24和BIU-87細胞凋亡的影響

5-aza-CdR處理T24和BIU-87細胞后，明顯增加了凋亡細胞數(shù)，呈時間依賴性(P＜0.05)(圖3)。

3 討論

2010年，全球新增35.7萬個膀胱癌病例，并有14.5萬個人死于膀胱癌。90%以上的膀胱癌為移行細胞癌(transitional cell carcinoma of the bladder，TCCB)，5% 為鱗狀細胞癌，2% 為腺癌［10－11］。75%的TCCB為非肌肉侵襲性的，具有高復發(fā)率，且容易發(fā)展為高度惡性腫瘤［12］;而肌肉侵襲性 TCCB(25%)預(yù)后不良［13］，經(jīng)過2年治療后，50%患者會發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移［14］。盡管外科手術(shù)治療，膀胱內(nèi)免疫、化學治療，以及一些新型化療方法(如酪氨酸激酶抑制劑、抗血管生成藥物等)應(yīng)用于膀胱癌，但患者的生存率并未提高［14］。而在過去十幾年中，眾多研究都致力于尋找一種無創(chuàng)傷，特異性強并具有靶

向性的分子生物學治療方法。這個工程巨大、過程復雜、冗長，所以找到一種綜合性的方法，更是亟待解決的問題。

表1 5-aza-CdR作用不同時間對T24和BIU-87細胞hepaCAM mRNA的影響Table 1 The effect of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM mRNA of T24 and BIU-87 cells in different times，A value，n=4)

表1 5-aza-CdR作用不同時間對T24和BIU-87細胞hepaCAM mRNA的影響Table 1 The effect of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM mRNA of T24 and BIU-87 cells in different times，A value，n=4)

＊P ＜0.05 compared with blank，24 or 48 hours．

group T24(3 μmol/L 5-aza-CdR) BIU-87(5 μmol/L 5-aza-CdR)blank 0.027±0.003 0.146±0.002 24 hours 0.032±0.001 0.098±0.003 48 hours 0.036±0.002 0.104±0.000 72 hours 0.716±0.008* 0.536±0.002*

表2 72 h時不同藥物濃度的5-aza-CdR對T24和BIU-87細胞hepaCAM mRNA的影響Table 2 The effect of different concentrations of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM of T24 and BIU-87 cell lines for 72 hours，A value，n=5)

表2 72 h時不同藥物濃度的5-aza-CdR對T24和BIU-87細胞hepaCAM mRNA的影響Table 2 The effect of different concentrations of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM of T24 and BIU-87 cell lines for 72 hours，A value，n=5)

#P ＜0.05 compared with blank or 0.3 or 1.0 μmol/L 5-aza-CdR;*P ＜0.05 compared with blank or 0.1 or 0.5 or 1.0 μmol/L 5-aza-CdR．

group T24 group BIU-87 blank 0.030±0.000 blank 0.196±0.002 5-aza-CdR 5-aza-CdR 0.3 μmol/L 0.028 ±0.001 0.1 μmol/L 0.197 ±0.006 1.0 μmol/L 0.037 ±0.002 0.5 μmol/L 0.178 ±0.002 3.0 μmol/L 0.164 ±0.008# 1.0 μmol/L 0.147 ±0.028 10.0 μmol/L 0.201 ±0.002# 5.0 μmol/L 0.647 ±0.007*

圖3 流式細胞技術(shù)檢測5-aza-CdR對T24和BIU-87細胞凋亡的影響Fig 3 The effect of 5-aza-CdR on apoptosis of T24 and BIU-87 cell lines was detected by FCM

5-aza-CdR是一種去甲基化藥物，可以抑制抑癌基因的甲基化，使眾多抑癌基因重新表達。迄今已有臨床Ⅰ，Ⅱ期試驗證實，在實體瘤中，如卵巢癌、雄激素依賴的前列腺癌、子宮頸癌等，5-aza-CdR難以達到預(yù)期的有效治療作用，后續(xù)的藥物效力仍在研究中;在血液的惡性腫瘤臨床Ⅰ，Ⅱ期實驗中，5-aza-CdR單劑量就對急性白血病有療效，對進展中的慢性粒細胞白血病有中等的療效［7］。但5-aza-CdR在膀胱癌中的研究和應(yīng)用甚少，故本研究先從體外實驗出發(fā)，用不同濃度的5-aza-CdR處理膀胱癌T24和BIU-87細胞，發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR可以抑制體外膀胱癌細胞的增殖，并可促使細胞凋亡;另一方面，從抑癌基因hepaCAM角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR可使hepaCAM基因重新表達。hepaCAM自2005年發(fā)現(xiàn)以來，一直都在研究其結(jié)構(gòu)和功能［8－9］，至于它在腫瘤組織中表達低下或缺失的原因研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR可逆轉(zhuǎn) hepaCAM基因表達，而5-aza-CdR又是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，可逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化，那么5-aza-CdR使hepaCAM重新表達的原因是否會由于5-aza-CdR逆轉(zhuǎn)了抑癌基因hepaCAM的甲基化;5-aza-CdR對膀胱癌細胞的抑制作用也是否也源于hepaCAM基因的重新表達，或者是其單純的抑制作用，又或者有兩種機制一起作用，這些問題都需要進一步的研究。然而，5-aza-CdR應(yīng)用于膀胱癌，可使很大一部分的抑癌基因得到重新表達，從另個方面又增強了抑制腫瘤生長的作用，故設(shè)想若結(jié)合精確的手術(shù)治療，常規(guī)化療，以及新型的藥物治療，比如5-aza-CdR，可能會給膀胱癌治療帶來新的前景。

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