秦媛媛， 楊 磊， 張慧靈， 沈夕坤

(1.蘇州中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009;2.蘇州大學(xué)藥理學(xué)教研室，腦血管病藥理研究室，江蘇 蘇州 215123)

腦中風(fēng)是一組以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，又稱腦卒中或腦血管意外，主要分為出血性腦中風(fēng) (腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)和缺血性腦中風(fēng)(腦梗死、腦血栓形成)兩大類，以腦梗死最為常見。目前中醫(yī)對(duì)于缺血性腦中風(fēng)常用活血化瘀、益氣活血等藥物進(jìn)行治療［1］。腦必通膠囊是由紅景天、三七、川芎和銀杏葉四味中藥組成的復(fù)方制劑，每種成分從天然植物的提取物精制而成，有助于促進(jìn)血?dú)庋h(huán)、活腦寧神。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已證明腦必通膠囊對(duì)大鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞所致的腦中風(fēng)具有保護(hù)作用 (待發(fā)表)。但腦必通膠囊對(duì)腦血流量及其血管內(nèi)皮細(xì)胞是否有影響，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討腦必通膠囊對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦血流量的影響及其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)表達(dá)的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量280～310 g，清潔級(jí)。由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［生產(chǎn)許可證 XCYK(蘇):2002－2008)，使用許可證 SYXK(蘇):2002－0037］。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)由ScienCell研究室提供。

1.2 藥物及試劑 腦必通膠囊，香港保健協(xié)會(huì)提供，批號(hào)為3GB081001。實(shí)驗(yàn)前用0.5% 羧甲基纖維素鈉 (CMC)配制。紅四氮唑 (TTC)，由國藥生產(chǎn)，批號(hào):RA1881;水合氯醛，五聯(lián)化工廠 (中國上海)，批號(hào):w20021122;多聚甲醛，天津市化學(xué)試劑研究所產(chǎn)品，批號(hào):20020308，iNOS兔多克隆抗體，武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 電子天平 (AL104 Mettler-Toledo公司)。動(dòng)物腦立體定位儀;激光多普勒血流儀 (ML191 ADInstruments公司);缺氧培養(yǎng)氣室 (MIC-101，Billups-Rothenberg);電泳儀 (power PAC 2000，Biorad公司);X光自動(dòng)洗片機(jī)(X-OMAT2000，美國KODAK公司);離心機(jī) (5810R，德國Eppendorf公司);基因擴(kuò)增儀 (MyCycler Thermal Cycler，美國BIORAD公司)。

2 方法

2.1 分組和給藥 取60只SD雄性大鼠，體質(zhì)量 (280±20)g，蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成6組，每組10只。(1)對(duì)照組:每天灌以0.5%CMC，假手術(shù)后24 h處死。(2)模型組:缺血24 h后處死。(3)腦必通大劑量組:按350 mg/(kg·d)劑量灌胃;腦必通中劑量組:按175 mg/(kg·d)劑量灌胃;腦必通小劑量組:按87.5 mg/(kg·d)劑量灌胃。(4)復(fù)方丹參滴丸陽性對(duì)照組:按67.5 mg/(kg·d)灌胃。各組均以1 mL/100 g體積灌服，連續(xù)7 d，末次給藥2 h后進(jìn)行手術(shù)，用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 對(duì)永久性大腦中動(dòng)脈阻塞 (pMCAO)模型大鼠腦血流量的影響 將麻醉大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，沿顱骨正中偏右切開皮膚及皮下組織，在大鼠前囟后1.5 mm，中線右側(cè)旁開5 mm處鉆一個(gè)直徑1 mm的小孔，該點(diǎn)為大腦中動(dòng)脈缺血中心區(qū)［2］。沿小孔插光纖探頭到大腦皮層表面，用血流儀配套的固定器固定光纖探頭，監(jiān)測(cè)腦中動(dòng)脈缺血 (MCAO)前的基礎(chǔ)值 (手術(shù)前)、MCAO后腦血流值 (手術(shù)后)，穩(wěn)定5 min后開始記錄數(shù)據(jù)。

2.3 含藥血清的制備 SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組3只，即 (1)正常對(duì)照組;(2)腦必通膠囊0.44 g/kg組 (小劑量);(3)腦必通膠囊0.88 g/kg組 (中劑量);(4)腦必通膠囊1.76 g/kg組 (大劑量)。

每組按1 mL/100 g灌胃，每天2次，連續(xù)3 d，第4天灌藥后1 h，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，經(jīng)56℃ 30 min滅活后，過濾滅菌，－80 ℃保存?zhèn)溆茫?］。

2.4 氧糖剝奪模型的建立 先將培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無糖DMEM培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)移置缺氧培養(yǎng)氣室中，同時(shí)打開有白色塑料鉗夾的聚丙烯管道的進(jìn)氣口和出氣口，將入口處的聚丙烯管道于包含有所需的混合氣體的源頭相連，向氣室內(nèi)充入95%的N2和5%的CO2氣體，將氣流自動(dòng)控制在每分鐘20 L，大約4 min氣室被完全充滿后，切斷氣體來源，關(guān)上白色的塑料鉗夾以緊閉氣室，最后將這個(gè)氣室置于37℃溫育。氧糖剝奪的時(shí)間分別是1、3、6、12、24 h。

2.5 Real-Time PCR HUVEC細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后，利用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA量。本實(shí)驗(yàn)采用的引物由寶生物工程 (大連)有限公司設(shè)計(jì)，上海皓嘉生物科技有限公司合成。引物序列如下:

HUVEC細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后3 h，收集置離心管，1 200 r/min離心5 min。棄上清并將其轉(zhuǎn)移至EP管中，加入1 mL trizol室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min。小心吸取上清液，移入新的離心管中 (切勿吸取沉淀)。小心吸取上清液，向EP管中加入三氯甲烷 (RNAiso Reagent的1/5體積量)，蓋緊離心管蓋，用力震蕩。待充分乳化溶液呈乳白狀后，室溫靜置5 min。從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中。向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30℃下靜置 10 min，離心。

2.6 Western Blotting HUVEC細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后，用超聲波細(xì)胞破碎儀在冰浴下超聲裂解細(xì)胞，－80℃ 保存?zhèn)溆?。? μL蛋白質(zhì)溶液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定以上所提取的蛋白濃度，調(diào)整上樣量，使各組蛋白總量一致，按次序上樣，安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物，電泳結(jié)束后，用蛋白轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，按轉(zhuǎn)移蛋白的常規(guī)方法進(jìn)行。

轉(zhuǎn)移終了，凝膠進(jìn)行蛋白染色液染色、脫色液脫色，以確定膠中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移情況。膜用TBST漂洗后。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，以TBST洗膜，室溫?fù)u動(dòng)。將硝酸纖維素膜加入封閉液中置常溫?fù)u動(dòng)。封閉結(jié)束后，將硝酸纖維素膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜加0.1 mL一抗溶液 (iNOS稀釋度為1∶500，5%脫脂牛奶溶于TBST中)，混勻后裝入袋中，去除帶內(nèi)所有氣泡，用封膜機(jī)封上開口，4℃過夜。棄去反應(yīng)液，TBST洗3次，每次10 min。在膜上加入二抗:IgG-HRP溶液 (1∶5 000，5%脫脂牛奶溶于 TBST中)，室溫下輕輕振蕩1 h取出膜，在PBS中洗膜3次，每次10 min。ECl顯色，壓片。

2.7 免疫熒光法 HUVEC細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后，用PBS洗滌3次;每孔加入1%BSA，室溫下避光搖1 h;每組相應(yīng)各孔加入相應(yīng)蛋白的第一抗體iNOS(1∶400)，室溫下振搖1 h，4℃孵育過夜;用PBS漂洗3次，加第二抗體，室溫下振搖1 h，PBS漂洗3次，貼片，封片，熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡下觀察，攝片。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)pMCAO大鼠局部相對(duì)腦血流量的影響 假手術(shù)組大鼠腦血流量無明顯改變。腦必通膠囊 175 mg/kg、350 mg/kg給藥7 d后顯著增加大鼠的基礎(chǔ)局部相對(duì)腦血流量(rCBF)(圖A1～A6，1B)。模型組rCBF降低至術(shù)前的9.79%，腦必通膠囊 87.5 mg/kg、175 mg/kg、350 mg/kg組rCBF分別降低至術(shù)前的13.35%、14.73%、16.66%，與模型組相比，腦必通膠囊中、大劑量組具有顯著性差異(圖1A，圖1C;P＜0.05，P＜0.01)。腦必通小劑量組pMCAO后與模型組比較亦有增高趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著水平 (圖1A1～A6，圖1C)，提示腦必通膠囊可以增加大鼠基礎(chǔ)及pMCAO后腦血流量。見圖1。

3.2 HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS mRNA表達(dá)時(shí)程變化及腦必通膠囊含藥血清對(duì)iNOS mRNA的表達(dá)影響 Real-Time PCR結(jié)果顯示:對(duì)照組HUVEC細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)較少，HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪3 h，iNOS mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，氧糖剝奪6 h、12 h、24 h iNOS mRNA表達(dá)較對(duì)照仍有較高表達(dá) (P＜0.05)。結(jié)果見圖2A。

為了證明腦必通膠囊含藥血清能否上調(diào)HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS mRNA的表達(dá)，采用Real-Time PCR觀察腦必通膠囊含藥血清對(duì)HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果證明:對(duì)照組HUVEC細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)較少，HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪3 h iNOS mRNA表達(dá)較對(duì)照顯著上調(diào) (P＜0.05，P＜0.01)，腦必通膠囊含藥血清大、中劑量組iNOS mRNA的表達(dá)較模型組顯著上調(diào)(P＜0.01)。結(jié)果提示:腦必通膠囊含藥血清可上調(diào)HU-VEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS mRNA的表達(dá)。結(jié)果見圖2B。

圖1 相對(duì)腦血流量的變化

3.3 HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS蛋白表達(dá)的時(shí)程變化以及腦必通膠囊含藥血清對(duì)iNOS蛋白表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示:對(duì)照組HUVEC細(xì)胞iNOS的蛋白量較低，氧糖剝奪處理組iNOS的蛋白量顯著增加 (P＜0.01)，氧糖剝奪3 h、6 h、12 h組與對(duì)照組比較有顯著性差異 (P＜0.01)，其中氧糖剝奪12 h組，iNOS的蛋白量到達(dá)高峰，氧糖剝奪24 h組iNOS蛋白量下降至接近于對(duì)照組水平。結(jié)果見圖3A，3C。

Western blotting結(jié)果同樣顯示:對(duì)照組HUVEC細(xì)胞iNOS的蛋白量較低;氧糖剝奪3 h、6 h、12 h組iNOS的蛋白量顯著增加 (P＜0.01);其中氧糖剝奪12 h組iNOS的蛋白量最高，腦必通膠囊含藥血清中、大劑量組可顯著增加iNOS的蛋白量 (P＜0.01)，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴性。提示腦必通膠囊含藥血清可增加HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后的iNOS蛋白量。結(jié)果見圖3B，3D。

免疫熒光結(jié)果顯示:對(duì)照組HUVEC細(xì)胞iNOS的表達(dá)量少，熒光極弱，主要分布在細(xì)胞漿;氧糖剝奪1 h組iNOS胞漿表達(dá)明顯增強(qiáng)，核內(nèi)可見少量熒光;氧糖剝奪3 h組iNOS胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，部分細(xì)胞胞核內(nèi)可見較多熒光顆粒，氧糖剝奪6 h、12 h組，細(xì)胞漿內(nèi)熒光更強(qiáng)，細(xì)胞核內(nèi)可見大量熒光顆粒，以氧糖剝奪12 h組表達(dá)最強(qiáng);氧糖剝奪24 h后熒光變?nèi)?，彌散在?xì)胞內(nèi)，但仍可見細(xì)胞核內(nèi)有熒光顆粒。結(jié)果見圖4A。

圖3 HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS蛋白水平的表達(dá)以及腦必通膠囊對(duì)iNOS蛋白表達(dá)的影響

圖4 HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS的表達(dá)以及腦必通膠囊對(duì)iNOS表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示:對(duì)照組HUVEC細(xì)胞iNOS的表達(dá)量少，熒光極弱，主要分布在細(xì)胞漿;氧糖剝奪12 h組，細(xì)胞核內(nèi)可見大量熒光顆粒，細(xì)胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著增加，腦必通膠囊含藥血清大、中劑量組可顯著增加細(xì)胞內(nèi)iNOS的熒光強(qiáng)度，大劑量組熒光顆粒增多明顯 (P＜0.01，P＜0.05)。提示腦必通膠囊含藥血清可增強(qiáng)HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后所致的iNOS的表達(dá)。結(jié)果見圖4B。

4 討論

腦必通膠囊是用天然植物川芎、銀杏葉等提取物精制而成，其總黃酮量達(dá)26.7%，有助于促進(jìn)血?dú)庋h(huán)、活腦寧神。雖然對(duì)中藥防治腦缺血的研究較多，但目前關(guān)于腦必通膠囊對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦血流量的影響及其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)的機(jī)制，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

當(dāng)腦血流降低到代謝物質(zhì)的運(yùn)輸不足以滿足代謝的需要時(shí)，即發(fā)生腦缺血損傷。腦缺血的中心問題是氧和能量的耗竭，因此及早增加腦組織氧和血液的供應(yīng)量是防治缺血性腦損傷的關(guān)鍵。應(yīng)盡早改善并維持缺血組織局部有效的供血，改善腦微循環(huán)障礙，減輕神經(jīng)元損傷［4］。激光多普勒血流測(cè)量 (LDF)可以無損傷性的快速反饋血流量的變化信息，可以連續(xù)、實(shí)時(shí)加監(jiān)測(cè)神經(jīng)組織微循環(huán)血流量，其測(cè)量范圍小，可以精確的動(dòng)態(tài)反映局部組織的微循環(huán)的血流動(dòng)力學(xué)［5］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用大鼠pMCAO模型研究了腦必通膠囊對(duì)腦缺血的影響，發(fā)現(xiàn)預(yù)先給藥350、175、87.5 mg/kg 1周，可顯著增加基礎(chǔ)及腦缺血后缺血局部腦血流量。腦必通膠囊的組成成分紅景天、三七、川芎和銀杏葉具有改善血液流變學(xué)指標(biāo)及抑制血小板聚集的作用，這些作用可能是腦必通膠囊增加腦血流量的機(jī)制之一。但腦必通膠囊對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞是否有直接作用?

NO是目前公認(rèn)的一種信息傳遞分子，在腦缺血損傷中具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性雙重作用［6］:即在腦缺血早期表現(xiàn)出保護(hù)作用，但NO濃度持續(xù)性增高可導(dǎo)致DNA和線粒體的功能損害，后期表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用［7］。腦缺血早期產(chǎn)生的NO可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶使cGMP水平升高，擴(kuò)張腦血管，從而增加缺血區(qū)腦血流，保護(hù)腦組織［6］。由于NO化學(xué)性質(zhì)活潑，不易準(zhǔn)確定量測(cè)定，其生物作用又完全依賴于NOS的活性，因而其合成酶一氧化氮合成酶(NOS)成為近年缺血性腦血管疾病研究的熱點(diǎn)。根據(jù)組織來源不同，NOS可分為神經(jīng)元細(xì)胞型 (nNOS)、內(nèi)皮細(xì)胞型 (eNOS)、誘導(dǎo)型 (iNOS)。誘導(dǎo)型NOS(iNOS)［6］，廣泛存在于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中。iNOS是一種非Ca2+依賴性的酶，在生理情況下，iNOS并不表達(dá)，但在病理情況下，一些細(xì)胞可誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成，生成iNOS，故誘導(dǎo)數(shù)小時(shí)后才顯示酶活力，且由于iNOS受DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，一經(jīng)誘導(dǎo)，長時(shí)間保持酶活力。iNOS基因表達(dá)調(diào)控區(qū)有低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的結(jié)合位點(diǎn)，HIF-1是缺氧調(diào)節(jié)iNOS基因表達(dá)所必需的［2］，血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧時(shí)iNOS基因表達(dá)增加［2］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用低糖結(jié)合物理性缺氧誘導(dǎo)氧糖剝奪所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型可模擬腦缺血損傷的具體過程［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后早期觀察到iNOS mRNA的上調(diào);亦觀察了HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后，iNOS蛋白的激活及核轉(zhuǎn)位的變化。HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS蛋白量即開始有所增加，并隨氧糖剝奪時(shí)間推移而逐漸增強(qiáng)，于12 h達(dá)高峰，24 h有所下降［2］。本實(shí)驗(yàn)觀察了預(yù)先給予腦必通膠囊含藥血清，HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦必通膠囊含藥血清可顯著上調(diào)iNOS mRNA表達(dá);增加HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS的蛋白水平［2，11］。結(jié)果提示腦必通膠囊增加大鼠局部腦血流量可能與其增加內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)，從而擴(kuò)張腦血管有關(guān)［11］。

本課題組最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 (待發(fā)表):腦必通膠囊對(duì)腦缺血的保護(hù)作用與其激活內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1信號(hào)通路有關(guān)［12］。大量研究表明低氧環(huán)境下引起HIF-1α的表達(dá)，HIF-1α與其靶基因中的低氧反應(yīng)元件 (HRE)結(jié)合，介導(dǎo)缺氧反應(yīng)，并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞保護(hù)作用［13］，從而調(diào)節(jié)血管舒縮反應(yīng)，增加缺血區(qū)腦血流，改善局部血液供應(yīng)，使缺氧的組織細(xì)胞保持氧穩(wěn)定，減輕缺血性腦損傷，發(fā)揮明顯的腦保護(hù)作用［13］。iNOS 是HIF-1α 的主要靶基因之一［3，14］，因此推測(cè)腦必通膠囊可能通過激活內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)。

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