張華鋒， 李曉坤， 楊 云， 張振凌， 石延榜， 杜紹亮

(河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008)

山藥是薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb．的干燥根莖，正宗的山藥為河南焦作的懷山藥，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃，生津益肺，補(bǔ)腎澀精［1］的功效，是著名的四大懷藥之一，在中醫(yī)臨床上應(yīng)用極為廣泛。懷山藥含淀粉、蛋白質(zhì)、游離氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分以及多糖 (包括黏液質(zhì)和糖蛋白)、尿囊素、淀粉酶、甾醇類、皂苷類等活性成分［2-9］，在軟化切制藥材時(shí)，泡潤(rùn)過度這些成分就會(huì)流失，還給飲片干燥帶來(lái)困難，泡潤(rùn)不透切片時(shí)就會(huì)沾刀、易碎?！吨袊?guó)藥典》2010年版山藥炮制項(xiàng)載“除去雜質(zhì)，分開大小個(gè)，泡潤(rùn)至透，切厚片，干燥”，藥典沒有規(guī)定具體參數(shù)，目前關(guān)于懷山藥軟化切制方面的研究也未見報(bào)道，而炮制上有“七分潤(rùn)工，三分刀工”的說(shuō)法，說(shuō)明切制前的軟化是影響飲片質(zhì)量的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［10-12］。本實(shí)驗(yàn)通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選懷山藥軟化切制最佳工藝，為懷山藥加工生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 懷山藥“光條”購(gòu)自河南省焦作市武陟縣，經(jīng)本院生藥教研室董誠(chéng)明教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷 Dioscorea opposita Thunb．的干燥根莖;尿囊素對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，編號(hào)100431-200401);甲醇為色譜純 (天津四友)，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC—20A高效液相色譜儀 (日本島津);METTLER AE240十萬(wàn)分之一精密天平 (瑞士);Sartorious BS224S萬(wàn)分之一精密天平 (北京賽多利斯公司);DZKW—4型水浴鍋 (上海東星建材實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);GS101—2D電熱鼓風(fēng)干燥器 (重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 尿囊素測(cè)定

2.1.1 色譜條件 迪馬鉑金ODS-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，0.5μm);流動(dòng)相為甲醇-水 (97∶3);體積流量0.7 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取尿囊素約5.2 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加20%甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻作為貯備液 (1.04 mg/mL)。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取貯備液分別配制成質(zhì)量濃度為1.04、0.52、0.26、0.13、0.065、0.032 5 mg/mL的溶液，精密吸取10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:y=208 328x+11 938(r=0.999 8)，表明尿囊素在0.325～10.4μL間線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD值為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品6份，按供試品溶液的制備方法處理后，按上述色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，計(jì)算尿囊素的量，RSD值為0.38%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μL，分別在2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.32%，表明供試品溶液常溫下在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的樣品0.5 g，共6份，分別精密加入一定量對(duì)照品，其余按供試品溶液制備方法操作制得供試品溶液，精密吸取10μL進(jìn)樣，計(jì)算得平均回收率為99.8%，RSD為1.01%(n=6)。

2.1.8 供試品溶液的制備及樣品測(cè)定 取各干燥樣品粉碎，過40目篩，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用20%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，再取續(xù)濾液即得供試品溶液。分別進(jìn)樣10μL，用外標(biāo)法計(jì)算。

2.2 浸出物測(cè)定 浸出物按照2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄XA浸出物測(cè)定法測(cè)定，其中水溶性浸出物采用冷浸法。

2.3 單因素考察

2.3.1 浸泡時(shí)間的考察 取大小均勻一致干燥至恒定質(zhì)量的懷山藥400 g，置儲(chǔ)水容器中，加約3L水淹沒過藥面，每隔5 h測(cè)定一次吸水量，結(jié)果見圖1。

吸水量=(浸泡后總藥材濕質(zhì)量－總藥材干質(zhì)量)/總藥材干質(zhì)量×100%

圖1 懷山藥浸泡吸水率測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of water absorption rate

由圖1可見，浸泡時(shí)間在16 h之前曲線上升比較平緩，16 h之后曲線上升開始變陡，表明藥材內(nèi)部水分?jǐn)U散速度加快，有效成分流失應(yīng)該發(fā)生在水分?jǐn)U散加快過程［4］。

2.3.2 悶潤(rùn)時(shí)間考察 取經(jīng)過浸泡的藥材，置密閉的潤(rùn)藥缸內(nèi)，整齊堆放，均勻噴淋清水，經(jīng)常翻動(dòng)檢查，保持藥材濕潤(rùn)狀態(tài)，直到藥材到達(dá)內(nèi)外軟硬一致便于切片目的。結(jié)果見表1。

表1 悶潤(rùn)時(shí)間考察結(jié)果Tab.1 Investigation results of moistening time

由表1可見，悶潤(rùn)時(shí)間過短不能達(dá)到軟化切制目的，時(shí)間過長(zhǎng)容易發(fā)霉，也給后期干燥帶來(lái)困難，結(jié)合切片情況用彎曲法看藥材的“水性”，藥材略彎曲，而不易折斷，即為合格。

2.4 因素水平設(shè)計(jì)及正交實(shí)驗(yàn)

2.4.1 因素水平設(shè)計(jì) 依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版 (一部)附錄ⅡD關(guān)于藥材炮制通則切制項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定，以浸泡時(shí)間、悶潤(rùn)時(shí)間、干燥時(shí)間、干燥溫度為考察因素，每個(gè)因素取三個(gè)水平，因素水平表如下 (表2)。

表2 懷山藥軟化切制工藝因素水平Tab.2 Factor-level table of softening and cutting process

2.4.2 正交試驗(yàn)安排 取大小均勻的懷山藥“光條”按正交試驗(yàn)表組合平行9份，用清水泡潤(rùn)至便于切片，烘干，得到9個(gè)不同條件下的樣品，分別編號(hào)為1～9。各指標(biāo)評(píng)分方法為:把含尿囊素量最大的樣品定位100，其它各樣品與該列最大值相比，再乘以100，即得該樣品得分，浸出物含有量評(píng)分方法相同。確定尿囊素x、水溶性浸出物y、醇溶性浸出物z的權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.3、0.3，通過公式W=0.4x+0.3y+0.3z，得到綜合評(píng)分W，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 正交試驗(yàn)表及結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of variance analysis

直觀分析結(jié)果，影響因素大小的順序?yàn)?A＞B＞C＞D。方差分析結(jié)果表明:A和B因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著意義，C因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著意義，D因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著意義。結(jié)合直觀分析和方差分析及生產(chǎn)實(shí)際，確定最佳搭配為A1B2C2D1，即懷山藥軟化切制的最佳方案為:浸泡10 h，后悶潤(rùn)22 h，切片厚度為3 mm，70℃干燥2.5 h。

2.4.3 最佳方案的驗(yàn)證試驗(yàn) 取400 g懷山藥“光條”按A1B2C2D1處理，重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of verification test

由表5可見，采用優(yōu)化后工藝進(jìn)行懷山藥的軟化切制，其指標(biāo)性成分含有量都較高，且工藝條件穩(wěn)定，重復(fù)性好。

3 討論

3.1 《中國(guó)藥典》2010年版要求山藥應(yīng)切成厚片，藥典附錄中規(guī)定厚片的厚度為2～4 mm，考慮到懷山藥粉性的質(zhì)地，切制過薄在炒制、干燥時(shí)易碎邊，煎煮時(shí)藥汁濃度高，影響其他配伍藥材的有效成分煎出;過厚則影響藥材本身的有效成分煎出，因此本實(shí)驗(yàn)的切片厚度定為3 mm。

3.2 本實(shí)驗(yàn)選擇水溶性浸出物和醇溶性浸出物作為指標(biāo)，是很有代表性的，因?yàn)閼焉剿幹卸嗵?、黏液蛋白、淀粉酶、游離氨基酸水溶性較強(qiáng);尿囊素和皂苷類成分醇溶性較強(qiáng)。采用多指標(biāo)綜合評(píng)判優(yōu)選懷山藥飲片的軟化切制工藝條件，符合中藥綜合作用的特點(diǎn)。

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