馬瑞麗， 張 蓉， 徐秀泉， 湯 建， 汪占弟， 歐陽臻*

(1．江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2．蘭州市動物疫病預防控制中心，甘肅蘭州730050)

大血藤為大血藤科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.et Wils.的藤莖，別名紅藤、紅皮藤、大活血等，主產(chǎn)于安徽、浙江、江西、湖北、廣西等地。具有清熱解毒、理氣活血、祛風殺蟲、消腫散結、止痛、通經(jīng)、敗毒等功效［1］。近年來藥理活性研究表明大血藤具有較強的抗氧化、抗菌以及抗炎免疫活性，臨床用以治療闌尾炎、月經(jīng)不調(diào)、崩漏、腸癰腹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、風濕痹痛、跌打腫痛等?；瘜W研究表明大血藤含有大量酚酸類物質(zhì)［2-5］，推測其為主要藥效活性成分之一。而酚酸類物質(zhì)作為一類具有獨特生理和藥理活性的天然產(chǎn)物，具有較強的抗氧化作用，在抑菌、抗腫瘤、防衰老和抗炎免疫等方面都具有良好的功效［6-7］。Li等［8］研究了45種植物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)大血藤甲醇提取物具有較高的抗氧化活性，并且總酚質(zhì)量分數(shù)為52.35 mg/g，高于其它44種植物。大血藤有降低佐劑性關節(jié)炎大鼠異常升高的TNF-α，IL-6水平，減輕局部炎癥的作用，可能與富含的多酚類成分有關［9-10］。但目前對大血藤總酚提取工藝的研究鮮有報道，本實驗首次研究了采用超聲提取法提取大血藤中總酚的提取工藝，應用響應面法 (response surface methodology，RSM)對超聲波提取工藝進行優(yōu)化，為大血藤中總酚酸的進一步開發(fā)和綜合利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KQ—250 DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)，UV—2550型紫外-可見分光光度計 (日本島津公司)，BS—110S型電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DHG—9145型鼓風干燥箱 (上海一恒科技有限公司)，HH—S2數(shù)字恒溫水浴鍋 (金壇市醫(yī)療儀器廠)，高速中藥粉碎機 (瑞安市永歷制藥機械有限公司)，S-2藥典檢驗篩 (浙江上虞市華康化驗儀器廠)。

1.2 試藥 大血藤藥材購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)鑒定為大血藤科植物大血藤Sargentodoxa cuneata Rehd．的藤莖。沒食子酸對照品 (批號:110831-200803)購自中國藥品生物制品檢定所，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑自制，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 總酚的測定 總酚測定參照文獻［11］，采用Folin-Ciocalteu法測定，略有改進，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線。

2.1.1 對照品溶液的制備 準確稱取沒食子酸標準品5.0 mg，置于100 mL量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，即得50μg/mL沒食子酸標準溶液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 標準曲線繪制 精密吸取沒食子酸對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，分別加入6 mL蒸餾水，混勻，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻，0.5～8 min內(nèi)加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻。75℃水浴10 min，以空白試劑調(diào)零，在760 nm波長下測定吸光度。每個濃度做3個平行試驗，取平均值，作標準曲線。以吸光值為縱坐標，總酚質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸分析，得回歸方程為:Y=0.117 4X+0.013 9，r=0.999 6。結果表明，質(zhì)量濃度在1～7μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備 準確稱取過《中國藥典》2號篩的干燥大血藤粉末適量，每份1 g，超聲提取之前加適量溶劑浸泡1 h，按單因素條件及表2中Box-Behnken試驗設計超聲提取 (通過加少量冷水控制溫度)。精密吸取各提取液的上清液300μL，蒸餾水定容至25 mL，搖勻，過濾即得。

2.1.4 供試品總酚量測定及總酚得率計算 精密吸取上述供試品溶液1 m L，按2.1.2項下操作方法測定吸光值，每個樣品重復3次，并根據(jù)回歸方程計算提取液質(zhì)量濃度，計算總酚得率。

2.2 提取工藝篩選

2.2.1 單因素實驗 根據(jù)預實驗結果，本實驗考察了含乙醇量 (40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，n=3)、提取溫度 (30、40、50、60、70℃，n=3)、料液比 (1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，n=3)、超聲時間 (0、20、30、40、50、60 min，n=3)、提取次數(shù) (1次、2次、3次，n=3)對大血藤總酚得率的影響。每次稱取1 g大血藤粉末進行實驗，取所得提取液的上清液稀釋后按2.1.2項下測定吸光值，根據(jù)回歸方程計算提取液中總酚得率，結果見圖1。

圖1 單因素試驗結果

單因素試驗結果表明:含乙醇量、提取溫度和提取時間對提取效果的影響較大;隨著料液比的增大，總酚得率在1∶10～1∶20緩慢增加，在料液比為1∶25時有最大值，之后隨料液比的增加，總酚得率反而降低;并且超聲提取一次總酚得率為9.85%，提取兩次總酚得率為10.15%，即提取一次幾乎可以將總酚類物質(zhì)完全提取。從經(jīng)濟效益方面考慮，本實驗選擇料液比為1∶25，超聲提取一次即可。

2.2.2 響應面分析因素水平及結果 根據(jù)單因素試驗確定的初步結果，采用響應面分析法中Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，以含乙醇量 (A)、提取溫度 (B)和提取時間 (C)3個因素為自變量，每個因素取3個水平，分別以-1、0、1編碼，以總酚得率為響應值，含乙醇量60%、提取溫度60℃、提取時間30 min為中心點施行響應面分析，進行3因素3水平試驗。因素水平見表1，結果見表2。

表1 響應面分析因素水平

2.2.3 響應面分析結果 使用統(tǒng)計軟件Design Expert 8.05b對表2中總酚得率數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到總酚得率對編碼自變量A、B和C的二次多項回歸方程:Y=10.59－0.34A+0.020B+0.51C－0.46AB+0.25AC－0.053BC－0.47A2－0.48B2－0.61C2。方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗結果見表3，回歸方程可信度分析見表4。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

由方差分析可知，此模型極顯著 (P＜0.001)，模型決定系數(shù)R2=0.962 4及失擬項不顯著 (P＞0.5)，說明方程擬合度和可信度均良好，試驗誤差小，故此模型可用于大血藤總酚提取工藝研究的分析和預測。

表3 方差分析結果

表4 回歸方程可信度分析

由表3可以看出，各因素中一次項C是極顯著的，其次是二次項C2;A、AB、AC、A2、B2均影響顯著，表明各影響因素對總酚得率的影響不是簡單的線性關系。一次項B和交互項BC影響不顯著，表明提取溫度和提取溫度與提取時間的交互作用對總酚得率的影響不顯著。響應面分析立體圖見圖2～4。

圖2 含乙醇量和提取溫度對總酚得率的影響

圖3 含乙醇量和提取時間對總酚得率的影響

圖4 提取溫度和提取時間對總酚得率的影響

由圖可知，各因素對總酚得率影響的大小依次為提取時間、提取濃度和提取溫度，其中提取時間 (C)的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較為陡峭，而含乙醇量和提取溫度次之，表現(xiàn)為曲面較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應值變化較小。

根據(jù)所得到的模型，可預測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最大響應值 (Y)為10.735%，對響應面結果利用軟件進行優(yōu)化分析，以總酚得率為評價指標，得到相應的提取工藝優(yōu)化條件為:乙醇 (A)為56.49%，提取溫度 (B)為61.71℃，提取時間 (C)為33.43 min。

2.2.4 驗證試驗 為檢驗響應面分析法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行大血藤總酚的提取試驗，考慮到實際情況，將修正后的最佳提取條件定為乙醇 (A)為56%，提取溫度 (B)為62℃，提取時間 (C)為34 min，提取1次，共進行3次平行試驗，得到大血藤總酚平均得率為10.629%(RSD為1.95%)，與理論預測值10.735%的相對誤差為－0.99%，與預測值接近，說明此模型可靠。

3 討論

本實驗采用Box-Behnken試驗設計法，首次對超聲提取法提取大血藤總酚的工藝進行了優(yōu)化，并建立了二次多項回歸模型。此模型極顯著，模型決定系數(shù)R2=0.962 4及失擬項不顯著，可用于大血藤總酚提取工藝研究的分析和預測。優(yōu)化后確定的大血藤總酚超聲提取的最佳工藝條件是含乙醇為56%，料液比為1∶25，在62℃下超聲提取時間34 min，提取一次即可。

酚類化合物是該藥材的主要活性成分之一，研究其總酚的提取工藝，為該藥材的進一步開發(fā)提供重要參考。本實驗首次報道了采用響應面分析法優(yōu)化大血藤中總酚超聲提取工藝，該工藝大大縮短提取時間，提取充分，能耗低，操作方便，是較為理想的提取總酚的方法。

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