華 影，唐曉磊，陳章權(quán)，于靜蕊

1遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州 121001；2武漢大學基礎醫(yī)學院，湖北武漢 430071；3廣東醫(yī)學院廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；4遼寧錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州 121001；5阜陽職業(yè)技術(shù)學院，安徽阜陽 236031

海星(sea star)是常見的海洋生物之一。近年來已發(fā)現(xiàn)多種海星活性物質(zhì)，如皂苷、甾醇、蒽醌、多糖、多肽、糖脂等，具有抗腫瘤、抗感染、抗心管病等作用[1-5]。課題組此前曾報道過南海多棘海星的提取物在NKT細胞激活以及抗腫瘤方面的研究工作[6-7]。國內(nèi)對海星抗真菌的研究僅見膠州灣羅氏海星皂苷類物質(zhì)抗酵母真菌的報道[8]，而海星抗皮膚真菌卻鮮有報道。因此本實驗做了對我國南海多棘海星提取物抗皮膚真菌的研究，報告如下。

材料和方法

1 材料 多棘海星(asteruzs rollestoni)采自中國湛江海域，由海南大學海洋學院方再光博士鑒定。紅色毛癬菌(tricophyton rubrum)5株，斷發(fā)毛癬菌(trichophyton tonsurans)和石膏樣小孢子菌(microsprum gypseum)各3株，由遼寧錦州市中心醫(yī)院皮膚科實驗室惠贈；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)購于青島海博生物技術(shù)有限公司；冷凍干燥機77520-01 Freezone b購自美國(Labconco公司)；Milli-Q超純水機；貝克曼-庫爾特波長掃描儀；96孔細胞培養(yǎng)板(Costar)；Bio-Rad TC-10細胞計數(shù)儀；Eppendorf培養(yǎng)箱；Agilent 1260型高效液相柱層析(HPLC)儀，Agilent ZORBAX GF-250型葡聚糖凝膠色譜柱(9.4 mm×250 mm，4 μm)和ZORBAX 300 Extend C18硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)均為美國Agilent公司產(chǎn)品，HPLC層析柱洗脫流動相所用甲醇、乙腈為色譜純，氟康唑(fluconazole)常州市第二制藥廠，批號930805。其余試劑均為國藥集團分析純。

2 海星水溶性成分的制備 取新鮮南海多棘海星，經(jīng)粉碎、冷凍干燥、除脂等處理[6-7]，加入2倍體積的去離子水，于4 ℃環(huán)境中連續(xù)攪拌24 h，400目紗布過濾后收集海星水提液，10 000 g離心10 min，將水相提取液pH調(diào)整為7.4，并于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

3 海星水提物特征吸收波長的確定 將提取的儲存液配制成3個濃度梯度，并以貝克曼波長掃描儀從190~900 nm進行連續(xù)掃描，對海星水提物中在某特定波長處有吸收峰的波長作為后續(xù)分離的檢測波長。

4 高效液相色譜法(HPLC)對水提物的分離 將水提物經(jīng)過高效液相色譜儀(HPLC)連以葡聚糖凝膠柱ZORBAX GF-250分離手段進行初步分離，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液為流動相，調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃，流速為1 ml/min，在213 nm波長處檢測。隨后利用高效液相色譜儀(HPLC)連以C18硅膠柱對首次分離的有效組分進一步分離。在ZORBAX 300 Extend C18硅膠色譜柱中以V水∶V乙腈∶V甲醇=60∶20∶20為流動相，調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃，流速為1 ml/min，在213 nm處進行檢測。

5 抗真菌的活性檢測 配制新鮮產(chǎn)孢子液體培養(yǎng)基：含L-谷酰胺而不含重碳酸鹽的RPMI1640培養(yǎng)基，使用0.165 mol/L 3-(N-嗎啡啉)丙磺酸調(diào)至pH 7.0，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌備用。初次分離的冷凍干燥后，稱取并用新鮮的液體培養(yǎng)基調(diào)至0.1 mg/ml備用。將26 ℃培養(yǎng)10 d后的PDA培養(yǎng)基中注入含0.05%吐溫-80 ℃的0.9%氯化鈉無菌溶液，適度震蕩并用無菌玻棒摩擦菌落表面，用200目濾網(wǎng)除去菌絲，用Bio-Rad細胞計數(shù)器計數(shù)，最終以配制的含有不同分離組分的液體培養(yǎng)基調(diào)孢子濃度至105/ml備用。設置空白對照(僅含有培養(yǎng)基)、氟康唑陽性對照組(氟康唑用少許二甲基亞砜助溶終濃度為10 μg/ml)、陰性對照和各提取組分實驗組，每組同時設置3個復孔。將培養(yǎng)板置于30 ℃，濕度80%~90% RH的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)96 h后，重新計數(shù)各培養(yǎng)孔中的孢子濃度。并計算孢子生長率：(提取物實驗組待測孔讀數(shù)－空白孔孢子讀數(shù)/陰性孔讀數(shù)-空白孔讀數(shù))×100%。在隨后對初次分離第3組分(FSF-3)抑制紅色毛癬菌的檢測中，用新鮮液體培養(yǎng)基將初次分離第3組分配制成終濃度分別為100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、12.5 μg/ml、6.25 μg/ml、3.12 μg/ml、1.56 μg/ml、0.78 μg/ml、0.39 μg/ml， 其 余 組 別設置及操作同上。FSF-3經(jīng)高效液相色譜連以C18硅膠柱分離各組分冷凍干燥后，稱量各組分并以新鮮液體培養(yǎng)基(上述)調(diào)至10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml進行抗菌檢測。其余組別設置及操作同上。

結(jié) 果

1 海星水提取物的波長掃描圖譜 將水提物配制成1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.1 mg/ml 3個濃度，在190~900 nm每間隔1nm進行連續(xù)掃描，測得各波長的吸光度值，發(fā)現(xiàn)在213 nm處有峰值，見圖1。

2 海星水提取物經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離圖譜 在葡聚糖凝膠柱中以pH 7.4的磷酸鹽為流動相，調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃，調(diào)節(jié)流速至1 ml/min，在213 nm處檢測，對海星水提取物各分離組分的響應度所繪制的峰圖，根據(jù)分離程度結(jié)合實驗需要分為5組主要成分，分別標記為FSF-1、FSF-2、FSF-3、FSF-4、FSF-5，見圖 2。

3 葡聚糖凝膠柱分離所得各組分抗真菌活性鑒定使用微孔稀釋法通過對96 h培養(yǎng)后各孔孢子濃度的測定，在同一菌種的藥物敏感性檢測中以(待測孔讀數(shù)－空白孔孢子讀數(shù)/陰性孔讀數(shù)-空白孔讀數(shù))×100%表示其孢子生長率(表1)，以及FSF-3組分抑制紅色毛癬菌的劑量依賴性的檢測，結(jié)果顯示隨著FSF-3濃度的降低抑菌效果逐漸減弱，當濃度低于0.78 μg/ml則無明顯抑菌效果，見圖3。

4 FSF-3組分分離圖譜 以V水∶V乙腈∶V甲醇=60∶20∶20為流動相，并以流動相溶解FSF-3至濃度為1 mg/ml，調(diào)節(jié)柱溫箱為23℃，調(diào)節(jié)流速至1 ml/min，通過C18硅膠柱按照極性差異，在213 nm處進行分離。根據(jù)分離情況分為3個主要組分，分別標記為SSF-1、SSF-2、SSF-3，見圖4。

5 FSF-3再次分離所得各組分抗真菌活性鑒定微量稀釋法檢測不同濃度SSF-1、SSF-2、SSF-3組分對紅色毛癬菌的抑制作用，見表2。

圖1 三種濃度海星水提取物的波長掃描Fig.1 Wavelength scan of water-soluble extracts from Asteruzs rollestoni at 3 different concentrations

圖2 海星水提取物在葡聚糖凝膠分離柱中的色譜圖FSF1-FSF5： 第一分離組分至第五分離組分Fig.2 Chromatogram of water-soluble extract from Asteruzs rollestoni by sephadex column FSF1-FSF5: The first separated fractions 1-5

圖3 不同濃度海星水提物組分FSF-3對紅色毛癬菌孢子生長率的影響Fig.3 Effect of FSF-3 at different concentrations separated from Asteruzs rollestoni on growth rate of Tricophyton rubrum spore

圖4 海星水提物FSF-3組分經(jīng)C18硅膠分離柱分離組分的色譜圖Fig.4 Chromatogram of FSF-3 separated by combined HPLC and C18 silicagel column SSF-1-3: secondary separated fractions 1-3

表1 葡聚糖凝膠柱分離各組分對三種真菌孢子生長率的影響Tab.1 Effect of every components from the separation of sephadex column on the growth rate of three kinds of fungal spore (n=3,%)

表1 葡聚糖凝膠柱分離各組分對三種真菌孢子生長率的影響Tab.1 Effect of every components from the separation of sephadex column on the growth rate of three kinds of fungal spore (n=3,%)

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表2 FSF-3經(jīng)C18硅膠分離柱分離所得三個組分對紅色毛癬菌孢子生長率的影響Tab.2 Effect of 3 components separaed by C18 silicagel column on growth rate of Tricophyton rubrum spore (n=3, %)

表2 FSF-3經(jīng)C18硅膠分離柱分離所得三個組分對紅色毛癬菌孢子生長率的影響Tab.2 Effect of 3 components separaed by C18 silicagel column on growth rate of Tricophyton rubrum spore (n=3, %)

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討 論

皮膚癬菌引起的淺部真菌感染一直是皮膚科臨床最常見的皮膚病[9]。目前臨床上使用的各種合成抗真菌藥物在一定程度上可以控制真菌的感染，然而其對人體均有一定的不良反應。本實驗首次對中國南海海域的多棘海星其體內(nèi)水溶性物質(zhì)的抗真菌活性展開研究，對海星水溶性物質(zhì)進行分離并與常見的3種皮膚癬菌共培養(yǎng)進行抑菌活性檢測，旨在從中篩選出具有抗菌活性的成分。

本研究在對提取物各組分的抑菌活性檢測中使用了微量稀釋法，該方法優(yōu)點是用藥量少，操作易標準化及可借助儀器判讀結(jié)果等。該技術(shù)已被推薦用于酵母菌的MIC測定，室間質(zhì)控結(jié)果證明效果滿意[10]。中國醫(yī)科院皮膚病研究所于1997年首次報道了微量稀釋法在測定皮膚癬菌最低抑菌濃度的實驗研究[11]。實驗中發(fā)現(xiàn)，此液體培養(yǎng)基的應用可有效的產(chǎn)生豐富的真菌孢子而只有極少量的菌絲以滿足后續(xù)實驗要求。

本文先將海星水溶性成分通過葡聚糖凝膠柱，根據(jù)分子量大小進行初次分離。將初次分離的組分與3種真菌共培養(yǎng)的結(jié)果顯示，在初次分離的FSF-3組分中含有對紅色毛癬菌有較強抑菌作用的物質(zhì)。紅色毛癬菌是臨床常見的皮膚癬菌，皮膚淺部真菌病60%以上是由紅色毛癬菌感染所致[9,12]。遂將FSF-3組分作為重點研究對象，追蹤具有抑菌活性的成分。對FSF-3的分離中使用了HPLC連接C18硅膠柱根據(jù)極性差異進行再次分離，經(jīng)過物質(zhì)分子量和極性的兩次分離，這樣保證了物質(zhì)成分較為單純。對各分離組分的抑菌活性檢測中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SF-3組分的MIC(middle inhibitor concentration)可達3.15 μg/ml，與同類提取物對紅色毛癬菌的抑菌濃度報道相比，其濃度顯著低于報道值[13-14]。而對FSF-3的進一步分離檢測發(fā)現(xiàn)，SSF-1組分對紅色毛癬菌的抑菌活性不明顯，而SSF-2及SSF-3對紅色毛癬菌均有一定的抑菌效果。推測SSF-2和SSF-3中可能存在著分子量大小接近而極性卻差異較為明顯的物質(zhì)。然而對該活性組分的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等信息仍需進一步的鑒定，并擬在動物水平上驗證其抗菌活性。上述研究為研制新型的海洋抗真菌藥物提供了方向和切入點。

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