孫秀艷，孫 博，李航旭，胡志元，王 輝，張曉毅

1第二炮兵總醫(yī)院 泌尿外科，北京 100088；2遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院 泌尿外科，遼寧錦州 121000

自體神經移植修復，存在可供移植神經來源有限，移植神經直徑與受體神經不匹配，供區(qū)神經功能喪失以及神經瘤形成等諸多弊端。因此，尋找不損害自身，能隨神經缺損長度及粗細裁剪，修復效果肯定的自體神經移植替代品，成為基礎和臨床工作者們不斷追求的目標[1]?？山到馊斯ず铣刹牧暇厶妓醽啽?poly propylene carbonate，PPC)是用二氧化碳和環(huán)氧丙烷合成的交替共聚物，將其與天然生物材料I型膠原(collagen typeⅠ，COL-Ⅰ)復合使用制作出的神經導管，既具有PPC的良好力學性能，又能促進細胞黏附與增殖，是一類具有良好應用前景的組織工程支架材料[2-3]。

材料和方法

1 實驗動物和設備 健康雄性Wistar大鼠20只，8周齡，體質量(250±20) g，由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供。CE1900型冰凍切片機(Leica公司，德國)，便攜式肌電圖儀(Medtronic Keypoint公司，丹麥)，Apollo 300掃描電鏡(CamScan公司，英國)，BIO-LINK BLX紫外交聯(lián)儀(Vilber公司，法國)，BH-2型OLYMPUS生物顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)，PPC(清華大學)。

2 Y型神經導管的制備 以氯仿為溶劑，配制濃度為0.1 g/ml的PPC溶液，使其在電壓為15 kV、噴絲頭與接收轉桶的間距為6 cm、流速為0.4 ml/h的條件下進行靜電紡絲，收集、干燥后獲得PPC支架。將Ⅰ型膠原溶于0.2 mol/L乙酸攪拌至完全溶解。配成10 g/L膠原溶液，離心除泡。將配成的溶液注入PPC制作的Y型神經導管內(圖1)。放入-20℃冰箱中，過夜。然后將神經導管置于-80℃凍干機內凍干48 h，取出后放進紫外線交聯(lián)儀中交聯(lián)30 min；經過紫外線交聯(lián)后置于PBS液浸泡12 h并沖洗3~5遍。用60Co輻照消毒，無菌保存[4-5]。

3 動物模型制備及分組 取20只實驗動物，隨機分為2組，每組10只。用10%水合氯醛注射液腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，取俯臥位，于L5-S4處為手術切口，分離出右側S1神經主干，切斷主干，造成近端主干與遠端分支間距達2 mm。導管組：用2 mm長Y型神經導管橋接S1神經缺損，分別用11-0縫合線將神經導管與S1神經主干縫合，使神經殘端套入管內各1 mm，逐層關閉切口。自體神經組：以自體神經代替神經導管，將自體神經原位縫合至各斷端，其余過程同導管組(圖2)。

4 電生理檢測 術后2周，實驗動物以10%水合氯醛注射液，腹腔注射麻醉后，取背部切口，顯露術側及正常側S1神經主干，行尿道運動誘發(fā)電位測定。刺激電極置于右側S1神經主干吻合口近側，記錄電極刺入尿道。電刺激參數：1.0 mA、0.1 ms、1.0 Hz，測量誘發(fā)電位潛伏期及波幅。

5 組織學觀察 完成電生理測定后處死動物，取材吻合口附近神經，縱向冰凍切片，行NF-200免疫組織化學染色。觀察吻合口處神經連續(xù)性情況。Y型神經導管NF-200免疫組織化學染色方法神經冰凍切片后室溫放置30 min，于純丙酮溶液中固定10 min，用PBS液沖洗(pH=7.4，0.01mol/L)5 min×3次。3% H2O2溶液中孵育5 min，用PBS液沖洗5 min×3次。切片中滴加NF-200鼠抗人一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜。用PBS液沖洗5 min×3次。切片中滴加TRITC(1∶100)(紅色)標記山羊抗小鼠二抗IgG，避光保存40 min。用PBS液沖洗5 min×3次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察[6-7]。

圖1 靜電紡絲裝置示意圖

圖2 導管橋接修復手術示意圖

結 果

1 神經導管形貌 大體觀，導管外觀呈Y型，質地均勻一致，管內填充物呈海綿狀(圖3)。掃描電鏡觀察神經導管縱切面，可見管內COL-I分布較為均勻(圖4)。

2 大體觀察 實驗動物手術部位無紅腫現象發(fā)生，切口愈合良好，無死亡，飲食正常。

3 電生理檢測 電極刺激S1神經主干吻合口近端。自體神經組可于尿道處記錄到運動誘發(fā)電位：潛伏期為(2.75±0.72) ms，波幅(2.35±0.83) mv。導管組記錄到運動誘發(fā)電位潛伏期為(1.34±0.56) ms，波幅(6.21±0.44) mv。見圖5、圖6。

4 組織學觀察 神經吻合口處連續(xù)性良好，吻合口周圍無粘連。NF-200染色顯示，S1神經主干神經纖維再生長入移植段近端吻合口。自體神經組可見軸突均已長入移植段遠端吻合口(圖7左)，導管組可見軸突均已長入移植段遠端吻合口(圖7右)。

圖3 Y型神經導管的大體觀察

圖4 掃描電鏡觀察，可見管內COL-I分布較為均勻(標尺長度=500 μm)

圖5 肌電圖

圖6 兩組肌電圖波幅潛伏期比較

圖7 神經NF-200染色(×50)

討 論

神經導管由天然或人工合成材料制成，具有特定的三維結構和生物活性，用于修復神經缺損，具有黏附支持細胞、引導軸突再生、保持軸突再生所需要的神經生長因子濃度等優(yōu)點，因此可達到引導和促進神經再生的目的。但是制作、合成神經導管的材料需要具有安全性、組織相容性、可降解性、滲透性、合適的彈性和機械強度等[8-10]。

PPC是脂肪族聚碳酸酯，由二氧化碳和環(huán)氧丙烷交替共聚而成，能完全生物降解，在自然條件下，PPC無定型結構，接近人體溫度或在人體內時，具有良好的韌性[5]。PPC玻璃化溫度較低，而且不易加工成型，但具有較低的彈性模量及較高的斷裂伸長率，已有研究將其與PLA、PHBV等生物醫(yī)用材料共混來改善這些材料的生物力學性能[9]。而且，有研究表明PPC與骨髓基質細胞有較好的親和性[11]。COL-I是膠原蛋白，目前組織工程學研究中COL-I是最為常用的天然生物材料之一，具有多方面的生物活性，不僅是組織支持物，而且還是細胞外間質的重要成分。COL-I可以促進細胞黏附及誘導生長分化，是良好的培養(yǎng)黏附劑，其降解產物能被細胞利用合成新的基質，不會產生毒性代謝產物，也不影響內環(huán)境pH值。本研究過程中，該導管降解時間為半年。2周取材時，神經導管周圍組織正常，未見神經水腫、導管降解等不良反應。以上結果表明，PPC復合COL-I神經導管具有良好的生物相容性。

總之，本研究中的PPC復合COL-I神經導管修復大鼠S1神經缺損研究結果表明，該神經導管對S1神經這種特殊部位的神經缺損有著良好的橋梁作用和促神經再生作用。為臨床修復神經缺損提供了新的途徑。

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