董 峰，唐紅衛(wèi)，吳小利，向代軍，蘭曉梅，徐 菡，王成彬

解放軍總醫(yī)院 臨檢科，北京 100853

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有氣道高反應(yīng)性、可逆性氣流受限，晚期還可出現(xiàn)氣道重塑。目前，全球范圍內(nèi)哮喘發(fā)病率及病死率逐年上升，但至今對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。鑒于人體實(shí)驗(yàn)的局限性及體外模型與體內(nèi)模型的巨大差異，科學(xué)家廣泛借助于動(dòng)物模型來研究哮喘。近年來，關(guān)于大鼠和小鼠過敏性哮喘模型的報(bào)道日益增多，一些文章[1-2]報(bào)道了利用氫氧化鋁干粉制作大鼠過敏性哮喘模型進(jìn)行哮喘研究，另一些文章[3-4]報(bào)道了利用氫氧化鋁凝膠制作大鼠哮喘模型進(jìn)行哮喘研究，但目前尚無關(guān)于氫氧化鋁干粉與凝膠制作大鼠哮喘模型效果差異的報(bào)道。本文結(jié)合目前開展的研究工作，分別用佐劑氫氧化鋁干粉、氫氧化鋁凝膠制作大鼠哮喘模型，比較兩種類型佐劑的造模效果。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(250±20) g，由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證書號(hào)：SCXK(京)2006-0009。

2 試劑與儀器 卵清蛋白(Grade V，Sigma公司)；氫氧化鋁干粉(Sigma公司)；滅活百日咳桿菌(天壇生物公司)；大鼠IFN-γ、IL-4檢測(cè)試劑盒(達(dá)科為公司)；高效組織細(xì)胞裂解液(索萊寶公司)。顯微鏡(Olympus公司)；酶標(biāo)儀(Awareness公司)；離心機(jī)(Thermofisher公司)。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。分別為A正常對(duì)照組，B氫氧化鋁凝膠造模組，C氫氧化鋁干粉造模組。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均在標(biāo)準(zhǔn)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，室溫20~25℃，12 h光照/黑暗周期。動(dòng)物自由飲水?dāng)z食。

4 模型制備 致敏參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。B組：于第1天、第8天在每只大鼠皮下多點(diǎn)注射OVA懸液(含1 mg OVA和200 mg Al(OH)3凝膠)，同時(shí)腹腔注射滅活百日咳桿菌6×109個(gè)；第15天起氣道內(nèi)滴入0.75%的OVA 200μl，1次/d，連續(xù)4 d激發(fā)。C組：于第1天、第8天在每只大鼠皮下多點(diǎn)注射OVA懸液(含1 mg OVA和200 mg AL(OH)3干粉)，同時(shí)腹腔注射滅活百日咳桿菌6×109個(gè)；第15天起氣道內(nèi)滴入0.75%的OVA 200μl，1次/d，連續(xù)4 d激發(fā)。A組：以0.9%氯化鈉溶液(normal saline，NS)為替代品進(jìn)行上述操作。

5 大鼠行為學(xué)觀察 激發(fā)后觀察大鼠是否出現(xiàn)呼吸急促、喘息、口唇紫紺、扭體、躁動(dòng)或行動(dòng)遲緩等表現(xiàn)。

6 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)采集及BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 最后1次激發(fā)結(jié)束24 h后，水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血致死后，迅速開胸行支氣管肺泡灌洗；BALF 1 000 r/min離心10 min，棄上清，立即加入1 ml NS重懸細(xì)胞沉淀、充池、計(jì)數(shù)。另取0.1 ml細(xì)胞重懸液涂片，瑞氏染色，分類計(jì)數(shù)嗜酸細(xì)胞百分比。

7 肺組織病理學(xué) 灌洗結(jié)束后，分離大鼠右肺組織，置于4%多聚甲醛中固定，制作病理切片，用于HE染色和PAS染色。

8 肺組織勻漿細(xì)胞因子含量檢測(cè) 取大鼠肺組織約100 mg，NS漂洗、除去血液、濾紙拭干后稱重，加入組織塊重量9倍的RIPA，制成10%的肺組織勻漿。將制備好的肺組織勻漿3 000 r/min離心15 min，取上清檢測(cè)IFN-γ、IL-4的含量，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以-x±s表示，以SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠行為學(xué)觀察 B組第1次激發(fā)后可見呼吸加深加快、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、腹肌收縮等喘息癥狀，及抓撓口鼻、口唇紫紺、扭體表現(xiàn)；C組第3次激發(fā)后也可見上述表現(xiàn)；A組無上述癥狀。

2 BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸細(xì)胞百分比 B組、C組BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)與A組相比顯著增高(P＜0.05)；B組BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)高于C組(P＜0.05)。同時(shí)，B組嗜酸細(xì)胞百分比高于A組和C組(P＜0.05)。見表1。

表1 灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果及嗜酸細(xì)胞百分比Tab.1 Cells and percentage of eosinophils in BALF

3 肺組織中細(xì)胞因子含量 與A組[(1 314.8±170.46)pg/ml]相比，B組[(929.1±172.07)pg/ml]和C 組 [(1 066±116.99)pg/ml]中 IFN-γ 含 量 顯 著降低(P＜0.01)。A組與B組大鼠肺組織勻漿中IFN-γ含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，所選試劑盒未能檢測(cè)出大鼠10%肺組織勻漿標(biāo)本中IL-4含量。

4 肺組織病理學(xué) HE染色：C組與A組相比，見氣道及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，嗜酸細(xì)胞有增多(圖1，C與A)；B組與A組相比，見氣道上皮損傷，結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管及血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，嗜酸細(xì)胞顯著增多，并浸潤各層(圖1，B與A)。PAS染色：與A組相比， B組杯狀細(xì)胞明顯增生(圖2，B與A)，C組可見杯狀細(xì)胞增生(圖2，C與A)。

討 論

大鼠及小鼠是常用的哮喘模型動(dòng)物，最常用的造模方法是使用OVA對(duì)動(dòng)物進(jìn)行致敏和激發(fā)，以復(fù)制哮喘氣道炎癥反應(yīng)過程。通常在OVA致敏環(huán)節(jié)中使用佐劑以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生預(yù)期的反應(yīng)類型。常用的佐劑有滅活的百日咳桿菌和氫氧化鋁。百日咳桿菌中的脂低聚多糖推進(jìn)以Th2為主導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)；文獻(xiàn)報(bào)道[6]用于疫苗的佐劑氫氧化鋁為不溶性膠狀沉淀，其作用原理是氫氧化鋁凝膠通過靜電與免疫原(OVA)結(jié)合，進(jìn)而增加OVA的免疫原性。氫氧化鋁佐劑與OVA同時(shí)給藥，可促進(jìn)Th2表型[7]。致敏結(jié)束后，通常會(huì)通過霧化、滴鼻或氣道內(nèi)滴入的途徑給予一定劑量的OVA以誘發(fā)哮喘發(fā)作。在本實(shí)驗(yàn)哮喘模型的制作過程中，B組與C組均采用了相同的操作、相同的致敏原(OVA)及滅活百日咳桿菌佐劑，唯一的區(qū)別在于氫氧化鋁干粉佐劑與氫氧化鋁凝膠佐劑，因此我們推斷：佐劑的不同導(dǎo)致了造模效果的差異。

哮喘模型成功與否可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)鼠哮喘發(fā)作的癥狀作出初步判斷。在本次試驗(yàn)中，第1次激發(fā)結(jié)束后觀察到B組大鼠出現(xiàn)了不同程度的呼吸急促、喘息、口唇及耳紫紺等，C組大鼠在第3次激發(fā)結(jié)束后也觀察到了上述癥狀。

過敏性哮喘的典型特征是氣道炎癥細(xì)胞浸潤，尤其是嗜酸性粒細(xì)胞增多。在BALF炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸細(xì)胞百分比這一指標(biāo)中，B組與C組顯著高于A組，并且B組計(jì)數(shù)結(jié)果顯著高于C組，這一結(jié)果證明B組氣道炎癥細(xì)胞浸潤更為嚴(yán)重。除氣道炎癥細(xì)胞浸潤外，哮喘反復(fù)發(fā)作還可使氣道壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在HE染色病理切片中，可見B組支氣管及血管周圍密集各種炎癥細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞，其中以嗜酸細(xì)胞大量浸潤最為特異，另外還可見氣道黏膜不規(guī)則增生，皺褶減少，上皮細(xì)胞有不同程度的壞死、脫落。在PAS染色的病理切片中，可見B組杯狀細(xì)胞顯著增生、黏液分泌增多。C組肺組織病理切片也可見上述表現(xiàn)，但C組病理改變明顯輕于B組。過敏性哮喘中存在Th1/Th2平衡紊亂。與A組相比，B組與C組大鼠肺組織勻漿中Th1細(xì)胞因子IFN-γ顯著降低，體現(xiàn)了哮喘病理狀態(tài)下Th1功能降低的特征。

以上指標(biāo)均證明大鼠哮喘模型制作成功，同時(shí)也體現(xiàn)了氫氧化鋁干粉造模與凝膠造模的差異。作為同一物質(zhì)的兩種不同形態(tài)，氫氧化鋁凝膠為膠體懸濁液，氫氧化鋁干粉為白色粉末狀物質(zhì)，不溶于水。田代印等[8]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁干粉與OVA不能很好混合，放置后出現(xiàn)明顯分層，作者在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了同樣的問題。相關(guān)研究報(bào)道[9]佐劑與抗原混合的程度會(huì)對(duì)抗原的免疫原性產(chǎn)生一定影響。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推斷：在哮喘造模中，氫氧化鋁凝膠增強(qiáng)OVA所致的過敏反應(yīng)的效果優(yōu)于氫氧化鋁干粉。

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