王俊鋒，劉金毅，方向群，徐 晨，郭英華，劉桂東，常 德，陸小冬，劉長庭

1解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853；2北京三元基因工程有限公司，北京 102600

空間環(huán)境存在著微重力、強(qiáng)輻射、高能粒子、交變磁場等多種獨(dú)特的作用，可以使生物發(fā)生一些基因變異。利用空間環(huán)境對質(zhì)粒上帶有目標(biāo)表型結(jié)構(gòu)基因的基因工程菌進(jìn)行太空誘變，可獲得產(chǎn)量高或者具有新性狀的突變菌株，從而提高生物制劑的產(chǎn)量[1-3]。本研究利用“神舟八號”飛船對表達(dá)重組人干擾素α1b的基因工程菌株進(jìn)行空間誘變，返回地面后篩選高表達(dá)目的產(chǎn)物的生物工程菌菌株。

材料和方法

1 菌株 重組人干擾素α1b菌種由北京三元基因工程有限公司提供。

2 培養(yǎng)基 LB(luria bertani)培養(yǎng)基：0.5%(w/v)酵母提取物(yeast extract)，1%(w/v)胰蛋白胨(tryptone)，1%(w/v)氯化鈉(NaCl)，雙蒸水補(bǔ)足體積。若配制固體培養(yǎng)基，則再加入1.5%~2%的瓊脂，充分?jǐn)嚢枞芙猓?21℃滅菌20 min。氨卞青霉素培養(yǎng)基(LB-Amp)：待LB培養(yǎng)基冷卻到50~60℃，加入100 mg/ml Amp 0.1%混勻。

3 菌種實(shí)驗(yàn)衛(wèi)星搭載 重組人干擾素α1b菌種搭載“神舟八號”飛船。該飛船于2011年11月1日發(fā)射，11月17日返回地面，在軌運(yùn)行398 h，全程運(yùn)行1 100萬公里。

4 菌種篩選 首先進(jìn)行平板分離：取250μl IFNα1b-2L1A菌液接種于裝有750μl 0.9%氯化鈉注射液的試管中，混勻；再取100μl稀釋后的菌液接種于裝有900μl 0.9%氯化鈉注射液的試管中，依次稀釋至第5管，取100μl涂布于LB平板，37℃靜止培養(yǎng)12~20 h?？剐云桨宄鹾Y：用滅菌槍頭挑取平板上不同大小的菌落單克隆，接入含有LB-Amp的平板，每板接種50個單克隆，共接種6板(共計(jì)300個單克隆)。同時(shí)在無抗性培養(yǎng)基上對照接種，37℃靜止培養(yǎng)5~7 h。試管復(fù)篩：用接種針挑取抗性平板上的單菌落，接入含有5 ml相同抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min震蕩12~16 h。

5 誘導(dǎo)表達(dá) 首先測定每管菌液的OD600，按照OD600=1.5接種500μl菌液的比例，將相同數(shù)量的菌量接種裝有5 ml LB-Amp培養(yǎng)基的種子試管，37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600在0.6~0.8之間，記錄各個試管中的OD600。然后加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為1 mmol/L，37℃、180 r/min震蕩誘導(dǎo)表達(dá)4 h。

6 目的蛋白第一輪SDS-PAGE分析 誘導(dǎo)結(jié)束后，取1 ml菌液離心，留取沉淀。向沉淀中加入75μl 10% SDS和75μl 8 mol/L尿素，混懸均勻后，超聲清洗儀內(nèi)超聲20 min，加入50μl 4倍還原性樣品緩沖液，混勻后沸水浴10 min，離心，取5μl上清進(jìn)行第一輪SDS-PAGE檢測。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后用Line軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度及純度。分別選擇每塊膠上目的條帶灰度或純度最大的克隆，總數(shù)不超過30個克隆。

7 目的蛋白第二輪SDS-PAGE分析 對上個步驟所選擇的單克隆集中在兩塊凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE檢測，上樣量為4μl。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后用Line軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度及純度。分別選擇每塊凝膠上目的條帶灰度或純度最大及次大的克隆，總數(shù)不超過8個。

結(jié) 果

1 抗性平板初篩 在抗性和非抗性平板均生長的陽性克隆為221株，占73.7%；僅在LB平板生長的陰性克隆數(shù)(抗性丟失)79株，占26.3%。

2 第一輪電泳分析篩選 對抗性平板初篩結(jié)果陽性克隆中編號在前的144株(克隆號1-194)進(jìn)行試管復(fù)篩和誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行電泳檢測和軟件分析。根據(jù)IFNα1b理論分子量19.4kU以及以往經(jīng)驗(yàn)，按照M1或M2的分子量進(jìn)行計(jì)算，以軟件分析IFNα1b條帶的灰度及純度，其中以灰度代表目的蛋白的總量，總灰度代表菌體總蛋白的量，純度代表目的蛋白占菌體總蛋白的比例。選取每次電泳15個克隆中灰度或純度最高的克隆用于下一輪檢測，灰度及純度最大值與次大值所對應(yīng)的克隆號中：37、64、93是重復(fù)出現(xiàn)，合并后為26個克隆，即5、18、19、25、37、41、49、60、61、62、64、77、87、93、105、112、113、127、139、147、149、159、175、178、191、194。

3 第二輪電泳分析篩選 對選出的26個克隆電泳樣品集中進(jìn)行SDS-PAGE并分析(見圖1)。選出4個克隆中灰度或純度最高的克隆，灰度及純度最大值與次大值所對應(yīng)的克隆號中：60、127是重復(fù)出現(xiàn)，合并后為6個克隆，即49、60、87、93、127、191。這6個克隆的兩輪檢測結(jié)果見表1。

圖1 26個克隆的第二輪電泳圖M1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上至下分別為：94.0、66.2、45.0、33.0、26.0、20.0和14.4 kU；M2為預(yù)染蛋白質(zhì)MarkⅢ，自上至下分別為：94、60、45、27、18 kU；C為重組人干擾素α1b對照品；圖下方最明顯的條帶為目的蛋白Fig. 1 Second SDS-PAGE gel images of 26 colonies M1 represents the standard protein MW from top to bottom,94.0, 66.2, 45.0, 33.0, 26.0, 20.0, and 14.4 kU. M2 is the Mark III of pre-stained proteins from top to bottom, 94, 60, 45, 27, and 18 kU. C represents the control of recombinant human INFα1b.The most obvious strip at the bottom is the target protein

表1 最后篩選到的六個克隆的兩輪檢測結(jié)果Tab. 1 Six colonies obtained after 2 time of screening

討 論

太空生物制藥是通過航天搭載來實(shí)現(xiàn)的[4-6]，具體來說，就是利用返回式空間飛行器，將生物制藥菌種或細(xì)胞送入太空，在地面難以模擬的太空環(huán)境下，促進(jìn)菌種或細(xì)胞的生長和變異，取得地面上無法獲得的誘變效果，如利用空間環(huán)境使相對呈漂浮伸展?fàn)顟B(tài)的生物染色體受到外界因素的沖擊，引起堿基的缺失、置換或插入(如引起生物DNA大分子斷裂，使雙螺旋中的氫鍵斷裂，或斷裂后再交叉聯(lián)接，或促使堿基降解)，從而改變基因內(nèi)部原有的堿基及排列順序，引起表型發(fā)生改變，產(chǎn)生新的遺傳變異，并且在返回地面后進(jìn)行培育、篩選得到生產(chǎn)性能優(yōu)良的微生物菌種或細(xì)胞，形成規(guī)?；a(chǎn)。而微生物和動植物細(xì)胞是目前藥品的主要來源，但有些藥物的地面生產(chǎn)能力非常有限，于是利用微生物和動植物細(xì)胞的航天搭載技術(shù)來生產(chǎn)出更多、性狀更好的藥物，成為航天技術(shù)應(yīng)用于制藥行業(yè)的重要課題。

重組人干擾素是一種常用的藥物，在臨床上應(yīng)用十分廣泛，它與細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，從而抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖以及提高免疫功能等作用[7-10]。目前市場上的重組人干擾素價(jià)格較貴，如果提高生物工程菌的產(chǎn)能，其價(jià)格也會相應(yīng)便宜。本研究選擇重組人干擾素α1b進(jìn)行“神舟八號”搭載，返回地面后經(jīng)過初步篩選獲得6株表達(dá)較高的空間誘變菌株，證實(shí)空間環(huán)境對生物工程菌的確存在誘變作用。通過空間多重因素交互作用下，產(chǎn)生了目的蛋白表達(dá)量不同的基因工程菌菌株。但空間誘變的具體機(jī)理還不是很清楚，空間環(huán)境中存在著微重力、強(qiáng)輻射、高能粒子、交變磁場等多種獨(dú)特因素，這些因素是如何作用？此次誘變過程是哪種因素占據(jù)了主導(dǎo)作用？均不是很清楚。另外，目前初步篩選出6株表達(dá)較高的空間誘變菌株，其表達(dá)量是否高于出發(fā)菌株？遺傳穩(wěn)定性怎么樣？目的蛋白的生物學(xué)活性是否發(fā)生改變？均尚需進(jìn)一步研究。

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