王立衛(wèi)，閆正，邢超，郭莎，葉玲菊

(河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定 071002)

李彥平

(保定市疾病預防控制中心，河北保定 071000)

葡萄酒生產(chǎn)工藝決定葡萄酒的生產(chǎn)需要一個較長的釀制過程。一些生產(chǎn)廠商為了快速謀取暴利，利用著色劑及其它原料勾兌生產(chǎn)假冒葡萄酒，嚴重危害人體健康。GB 15037–2006［1］規(guī)定，葡萄酒中不得添加合成著色劑、甜味素、香精、增稠劑。人工合成著色劑莧菜紅及亮藍是兩種較常使用在葡萄酒中的人工合成色素。因此葡萄酒中莧菜紅及亮藍的監(jiān)測具有重要意義。

GB/T 5009.35–2003［2］規(guī)定食品、飲料、配制酒中合成著色劑的測定方法有高效液相色譜法［3］、薄層色譜法［4］、示波極譜法［5］，這些方法均需樣品預處理，操作繁瑣，不利于快速分析。GB/T 15038–2006［6］中未介紹葡萄酒中合成色素的檢測方法，葡萄酒中添加劑的檢測多借鑒飲料或配制酒的檢驗方法。高效液相色譜法經(jīng)聚酰胺粉吸附法處理樣品后，進行定量分析時準確度變差；薄層色譜法分辨率、靈敏度及準確度均較低；示波極譜法對環(huán)境有污染且受干擾因素影響較多，定性較為困難。另外食品中人工色素的分析方法還有分光光度法［7］、高效液相色譜 – 質(zhì)譜法［8］、高效毛細管電泳法［9］等。筆者建立了高效毛細管電泳法直接測定葡萄酒中莧菜紅及亮藍的方法，該方法不需樣品預處理，操作簡便，分析速度快，可為葡萄酒中人工色素的測定提供新的參考方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效毛細管電泳儀：TH–3000型，保定天惠分離科學研究所；

未涂層毛細管：河北永年光導纖維廠；

自動雙重純水蒸餾器：SZ–93型，上海亞榮生化儀器廠；

酸度計：pHS–3C型，上海偉業(yè)儀器廠；

檸檬酸、β–環(huán)糊精、氫氧化鈉、鹽酸：分析純；

莧菜紅、亮藍：國家標準物質(zhì)研制中心；

葡萄酒樣品：保定市疾病預防控制中心；

實驗室用水均為二次蒸餾水。

1.2 溶液配制

樣品緩沖溶液：10 mmol/L檸檬酸。

標準溶液：分別移取 0.10，0.25，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 mL 的0.5 mg/mL莧菜紅標準品溶液及0.5 mg/mL亮藍標準品溶液于25 mL容量瓶中，用樣品緩沖溶液定容至標線，搖勻，配制成2，5，10，20，40，100，200 mg/L 的莧菜紅及亮藍標準溶液。

1.3 電泳分離條件

分離緩沖溶液：10 mmmol/L檸檬酸溶液–5 mmmol/L β– 環(huán)糊精溶液 (pH 2.6)；未涂層彈性石英毛細管柱：50 cm×75 μm，有效長度為39 cm；壓力進樣：20 kPa，3 s；電泳電壓：20 kV；電泳溫度：室溫；檢測波長：220 nm。

新毛細管在使用前以1 mol/L鹽酸溶液及1 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗20 min，然后用二次蒸餾水和分離緩沖液分別沖洗5 min。每次分析樣品后用分離緩沖溶液沖洗毛細管柱2 min以保證重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

亮藍在紫外區(qū)最大吸收波長為220 nm，莧菜紅在220 nm處亦有較大紫外吸收［10］，緩沖溶液背景在220 nm處干擾較小。為實現(xiàn)兩者的同時測定且在獲得盡可能高的靈敏度同時避免基體干擾，本實驗選擇220 nm作為檢測波長。

2.2 分離緩沖體系選擇

莧菜紅及亮藍分子結(jié)構(gòu)中均含有磺酸基，在一定條件下電離成帶一個或多個負電荷的粒子，產(chǎn)生電泳行為。在堿性條件下，莧菜紅及亮藍分子電離后帶負電荷，正極進樣后其電遷移方向為負極到正極，與電滲流方向相反，當電滲流足夠大時才能從負極流出毛細管柱，產(chǎn)生色譜峰。在酸性條件下，負極進樣后，其電遷移方向為負極到正極，當離子電泳淌度大于電滲淌度時可從正極流出毛細管柱，產(chǎn)生色譜峰。分別選取磷酸鹽體系、NaAc–HAc體系、硼砂體系及檸檬酸緩沖體系進行試驗，結(jié)果表明，磷酸鹽體系及硼砂體系中莧菜紅不出峰，且分析樣品時雜質(zhì)峰干擾嚴重；而在NaAc–HAc體系中亮藍及莧菜紅出峰時間過長；檸檬酸緩沖體系中莧菜紅及亮藍保留時間合適且峰形較尖銳，測定樣品時莧菜紅及亮藍先于雜質(zhì)峰流出，避免了雜質(zhì)干擾。本實驗最終選擇檸檬酸緩沖體系，和絕大多數(shù)實驗所選用的堿性硼砂體系與磷酸鹽體系不同［11，12］。

2.3 分離緩沖溶液pH值對遷移時間的影響

毛細管的電滲流(EOF)對于pH值的改變很敏感，且pH值變化亦可引起分離度以及峰形等參數(shù)的改變。較低pH值的檸檬酸緩沖溶液中可以抑制緩沖溶液的電滲流，改變pH值可以改變莧菜紅及亮藍的電泳分離度，提高莧菜紅及亮藍的分離效率?？疾炝藱幟仕崛芤涸趐H 2.2～3.0范圍內(nèi)對遷移時間的影響(見圖1)。結(jié)果表明，兩者在pH 2.2～3.0范圍內(nèi)均能達到完全分離，在pH 2.4時兩者的保留時間最短，但在測定樣品時當pH 2.4時亮藍不出峰，最終選擇緩沖溶液為pH 2.6。

圖1 pH值對莧菜紅及亮藍的保留時間的影響

2.4 分離緩沖液濃度對分離效果的影響

在恒定條件下，增大緩沖液的濃度可以抑制吸附而增加靈敏度，降低電滲流而增加分離效率，但濃度太高會產(chǎn)生較多熱量。在保持pH值及分離電壓不變的條件下，考察5種不同濃度檸檬酸溶液對莧菜紅及亮藍分離情況的影響(見圖2)。結(jié)果表明，隨著檸檬酸溶液濃度的增大，分離時間變短，在10 mmol/L時莧菜紅及亮藍峰分離度最大，且保留時間較短，最終選擇檸檬酸溶液濃度為10 mmol/L。

2.5 添加劑對峰形及分離度的影響

考察了十二烷基磺酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)及β-環(huán)糊精對樣品中莧菜紅及亮藍分離情況及峰形的影響，發(fā)現(xiàn)SDS及CTAB對樣品中莧菜紅及亮藍的分離情況及峰形無明顯改善，而β-環(huán)糊精在分析樣品中的莧菜紅及亮藍時，可明顯改善峰形，使峰形變銳?？疾炝瞬煌瑵舛圈?環(huán)糊精對峰形的影響，發(fā)現(xiàn)當β-環(huán)糊精濃度大于5 mmol/L后，莧菜紅及亮藍的峰形變化不明顯，且環(huán)糊精容易析出，最終確定β-環(huán)糊精的濃度為5 mmol/L。

圖2 檸檬酸濃度對莧菜紅及亮藍保留時間的影響

2.6 標準工作曲線與檢出限

在1.3實驗條件下對莧菜紅及亮藍標準品進樣分析，以電泳譜圖的峰面積y(μV·s)與對應的質(zhì)量濃度x(mg/L)進行線性回歸分析，得到莧菜紅及亮藍的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)及檢出限(LOD，信噪比為3)，結(jié)果見表1。

表1 莧菜紅及亮藍的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.7 方法精密度及回收率

取1 mL樣品于5 mL刻度試管中，用樣品緩沖溶液定容至5 mL，混合均勻后直接進樣，按1.3實驗條件進行測定，平行測定7次，計算測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表2，莧菜紅及亮藍色譜峰見圖3。由表2可知，本實驗測定莧菜紅的方法精密度為1.5%，亮藍的方法精密度為2.9%，表明本方法精密度良好。

表2 樣品中的莧菜紅及亮藍

取3份已測樣品，分別加入低、中、高3個濃度水平的莧菜紅及亮藍標準品，按1.3實驗條件進樣測定，每個加標水平樣品平行處理6份，莧菜紅及亮藍的加標回收率見表3。

圖3 優(yōu)化條件下樣品中莧菜紅及亮藍的電泳圖

表3 樣品加標回收率及相對標準偏差(n=6)

3 結(jié)語

用高效毛細管電泳法直接測定葡萄酒中莧菜紅及亮藍人工合成色素，該方法具有較高的靈敏度和分辨率，且分離快速、操作簡單、節(jié)省溶劑、用樣量少，能滿足實際樣品的分析需求。

［1］GB 15037–2006 葡萄酒［S］.

［2］GB/T 5009.35–2003 食品中著色劑的測定［S］.

［3］Minioti K S，Sakellariou C F，Thomaidis N S. Determination of 13 synthetic food colorants in water-soluble foods by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector［J］. Analytica Chimica Acta，2007，583(1): 103–110.

［4］嚴浩英，張軍，李淑華，等.五種人工合成食用色素的薄層色譜掃描分析［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，1997，24(2): 192–194.

［5］宋新，紀雙利，楊麗，等.示波極譜法在食品合成食用色素測定中的應用［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2009，21(5): 422–423.

［6］GB/T 15038–2006 葡萄酒、果酒通用試驗方法［S］.

［7］劉冷，李建晴，郭芬，等.紫外分光光度法同時測定檸檬黃和日落黃［J］.光譜實驗室，2007，24(3): 423–427.

［8］伊雄海，鄧曉軍，楊惠琴，等.液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中的多種易濫用著色劑［J］.色譜，2011，29(11): 1 062–1 069.

［9］閆正，李盈辰，張玉.改良聚酰胺吸附–高效毛細管電泳內(nèi)標法測定飲料中的亮藍和莧菜［J］.色譜，2010，28(12): 1 185–1 188.

［10］龍巍然，王興益，史振雨，等.膠束電動毛細管色譜同時測定食品中13種人工合成色素［J］.分析測試學報，2012，31(9):1 100–1 104.

［11］Huang H Y，Shih Y C，Chen Y C. Determining eight colorants in milk beverages by capillary electrophoresis［J］. Journal of Chromatography A，2002，959(1/2): 317–325.

［12］杜建中，些薇薇，蔡泉林，等.毛細管電泳法直接分離測定果凍中的色素［J］.食品科學，2012，22(4): 173–177.