陳海燕　張文鴻　朱正虎　石飛

摘 要：本文通過(guò)改變高效液相色譜的流動(dòng)相研究對(duì)3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸的出峰峰形的影響。從而說(shuō)明流動(dòng)相對(duì)檢測(cè)結(jié)果的重要性。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;流動(dòng)相;峰形

3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸是二硝托胺（球痢靈）中間體，二硝托胺（球痢靈）化學(xué)名為3，5-二硝基鄰甲基苯甲酰胺。二硝托胺（球痢靈）結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

二硝托胺常作為抗球蟲(chóng)藥，用于雞球蟲(chóng)病。在飼料行業(yè)中成為搶手貨，頗受?chē)?guó)內(nèi)外用戶(hù)的青睞。需求量比較大。對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來(lái)越高。中間體的質(zhì)量決定了產(chǎn)品的質(zhì)量和效益。因此對(duì)3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸進(jìn)行分析。其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

原來(lái)二硝托胺中間體的檢測(cè)方法是測(cè)其熔點(diǎn)，該物質(zhì)為淺黃色粉末，熔點(diǎn)：198℃-205.0℃。熔點(diǎn)儀測(cè)試該物質(zhì)有一定的局限性。因現(xiàn)在的儀器越來(lái)越先進(jìn)，越來(lái)越精密，對(duì)于該物質(zhì)完全可以用科學(xué)有效的分析方法來(lái)測(cè)定。高效液相色譜法（HPLC）來(lái)鑒別和分析該物質(zhì)是有效可靠的方法。HPLC的優(yōu)點(diǎn)：速度快，分辨率高，靈敏度高，柱子可反復(fù)使用，使用樣品量少。不同的物質(zhì)需要不同性質(zhì)的柱子和相應(yīng)流動(dòng)相的配比。高效液相色譜法是目前及其常見(jiàn)的分析方法。在高效液相色譜法中，測(cè)定法有4種：內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、主成分自身對(duì)照法、面積歸一化法。有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)常用外標(biāo)法、主成分自身對(duì)照法、面積歸一化法，其中主成分自身對(duì)照法又分為加校正因子主成分自身對(duì)照法，不加校正因子主成分自身對(duì)照法。本文主要討論面積歸一化法。

1 高效液相色譜

高效液相色譜目前在檢測(cè)工作中廣泛使用，對(duì)檢驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制是保證結(jié)果可靠、準(zhǔn)確的基本要求。在高效液相檢測(cè)過(guò)程中，通過(guò)綜合使用系統(tǒng)適用性、空白分析、質(zhì)控樣品、重復(fù)分析、室內(nèi)質(zhì)量控制、不確定度評(píng)定等質(zhì)控手段，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估原則選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)控手段，從而保證高效液相檢測(cè)過(guò)程中的質(zhì)量，保證便捷、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的高效液相檢測(cè)結(jié)果。高效液相色譜法一要了解其分離的基本原理，二要了解其的基本構(gòu)造，三要了解其的基本操作。

在高效液相測(cè)試中流動(dòng)相要求和配比在高效液相色譜操作過(guò)程中起關(guān)鍵作用。流動(dòng)相的性質(zhì)要求：一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相應(yīng)具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

流動(dòng)相選擇：①由強(qiáng)到弱：一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或緩沖溶液）進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑（乙腈或甲醇）的比例;②三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑（甲醇或乙腈）的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況;③粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

流動(dòng)相的脫氣：HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線(xiàn)穩(wěn)定性，甚至使無(wú)法檢測(cè)。

流動(dòng)相的濾過(guò)：所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm（或0.22μm）濾過(guò)，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明“已濾過(guò)”）。

流動(dòng)相的貯存：流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。一般情況下，甲醇--水系統(tǒng)已能滿(mǎn)足多數(shù)樣品的分離要求，且流動(dòng)相粘度小，價(jià)格低，是反相色譜最常用的流動(dòng)相。乙腈--水系統(tǒng)，因?yàn)榕c甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，看起來(lái)乙腈--水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇--水系統(tǒng)。但參考資料：乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍，價(jià)格是甲醇的6-7倍。擇優(yōu)選擇溶劑是流動(dòng)相的關(guān)鍵。流動(dòng)相首選甲醇--水系統(tǒng)，應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相。如為堿性流動(dòng)相的pH值應(yīng)為7～8，如為酸性流動(dòng)相的pH值應(yīng)為3～4。綜上所述，對(duì)3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸的測(cè)定首選甲醇--水系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 儀器設(shè)備及試劑

檢測(cè)儀器：Waters2489檢測(cè)器，515泵。

色譜柱：Kromasil C184.6×150mm或同等柱子。

天平：Mettler AB135S或同等設(shè)備。

玻璃儀器：A級(jí)計(jì)量?jī)x器或同等儀器。

水：二次蒸餾水。

甲醇：HPLC級(jí)。

樣品：3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸。

2.2 實(shí)驗(yàn)操作

條件1：流動(dòng)相：甲醇：水=500：500;波長(zhǎng)230nm。

樣品制備：稱(chēng)取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品100.9mg

于100mL容量瓶中，濃度：1.009mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL該溶液于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相（甲醇：水=500：500）稀釋至刻度。

色譜條件：波長(zhǎng)：230nm;進(jìn)樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運(yùn)行時(shí)間10min。

具體分析如圖3：

條件2：流動(dòng)相：甲醇：水：稀磷酸=300：700：60;波長(zhǎng)230nm。

樣品制備：稱(chēng)取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品100.9mg，于100mL容量瓶中，濃度：1.009mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL溶液，用流動(dòng)相（甲醇：水：稀磷酸=300：700：60）稀釋至100mL。

色譜條件：波長(zhǎng)：230nm;進(jìn)樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運(yùn)行時(shí)間30min。

具體分析如圖4：

條件3：流動(dòng)相：甲醇：水：稀磷酸=700：300：60;波長(zhǎng)230nm。

配成700：300：60的甲醇：水：稀磷酸（0.17%）流動(dòng)相，混合均勻，使用前用0.45um濾膜過(guò)濾，使用前脫氣。

樣品制備：稱(chēng)取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品99.9mg，

于100mL容量瓶中，濃度：0.999mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL溶液，用流動(dòng)相（甲醇：水：稀磷酸=700：300：60）稀釋至100mL。

色譜條件：波長(zhǎng)：230nm;進(jìn)樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運(yùn)行時(shí)間15min。

具體分析如圖5：

3 結(jié)果討論

對(duì)比上述三張圖譜觀察發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇：水=500： 500時(shí)，出峰時(shí)間很早，并且主峰不對(duì)稱(chēng)，拖尾因子超過(guò)1.8，此方法不適用。當(dāng)在流動(dòng)相中加入稀磷酸配制成甲醇：水：稀磷酸=300：700：60時(shí)，出峰時(shí)間太晚。然后又通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相中各成分比例，配置成甲醇：水：稀磷酸=700：300：60時(shí)，出峰時(shí)間已經(jīng)峰形都比較合適。

所以流動(dòng)相的選擇對(duì)檢測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果起著很關(guān)鍵的作用，我們可以通過(guò)了解產(chǎn)品的性狀，進(jìn)行流動(dòng)相測(cè)試試驗(yàn)選擇合適的流動(dòng)相，對(duì)我們的產(chǎn)品檢測(cè)有著很好的效果體現(xiàn)。

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