余 華，熊浚智，何曉梅，盛哈蕾，蔡文強(qiáng)，謝 瑋，張克斌

銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，Pa）又稱綠膿桿菌，是臨床最常見(jiàn)的條件致病菌，具高度的環(huán)境適應(yīng)力和耐藥性。在燒傷、創(chuàng)傷、免疫缺陷、器官移植、肺囊性纖維化及一些醫(yī)院感染病人中引起嚴(yán)重感染。Pa彈性蛋白酶（elastase，LasB）由lasB基因編碼［1］，是其最主要的分泌型蛋白酶及毒力因子，與其致病性密切相關(guān)。目前對(duì)彈性蛋白酶在該菌侵襲力和致病性中的作用有一些研究［2］，但尚欠系統(tǒng)和深入。如果能獲得無(wú)彈性蛋白酶活性的Pa菌株，將為更全面深入研究彈性蛋白酶在Pa中的致病機(jī)理，以及細(xì)菌與宿主相互關(guān)系等方面提供材料和基礎(chǔ)。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的利用λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統(tǒng)，具有重組效率高、所需同源序列短、可定點(diǎn)進(jìn)行基因敲除、敲入、點(diǎn)突變等操作的特點(diǎn)［3］。目前，Red重組酶系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌的基因修飾中［4－5］，但現(xiàn)有的Red重組酶質(zhì)粒（如p KD46）所具有的溫敏性復(fù)制子oriR101和rep A不能在Pa中進(jìn)行復(fù)制，從而極大地限制了其在Pa基因修飾中的運(yùn)用。然而含有p RO1610復(fù)制子的p UCP系列質(zhì)粒，可在Pa、大腸桿菌及多種革蘭氏陰性菌中穩(wěn)定復(fù)制［6］。為此，本研究通過(guò)構(gòu)建含有Red重組酶基因的穿梭質(zhì)粒p UCP－Red，采用雙臂同源重組法以獲取敲除lasB基因的Pa菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、Pa野生株（PAO1）為本室保存。質(zhì)粒pJQ200SK由第三軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室李明博士惠贈(zèng)；p KD46、p MD18T和p UCP載體為本室保存。1.2 主要試劑和儀器 DNA限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)于Ta KaRa公司；DNA連接酶、聚合酶和熒光定量PCR酶購(gòu)于TOYOBO核酸公司；細(xì)菌基因組提取、膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于天根生物公司；電轉(zhuǎn)儀購(gòu)于Bio－Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物

表1 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物Tab.1 PCR primers used in this study

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 PAO1/p UCP－Red基因敲除體系構(gòu)建

1.4.1.1 p UCP－Red質(zhì)粒構(gòu)建 設(shè)計(jì)特異性 PCR引物，見(jiàn)表1。從p KD46上擴(kuò)增Red重組酶基因 （含有受阿拉伯糖啟動(dòng)子調(diào)控的exo、bet和gam基因）。通過(guò)常規(guī)的酶切、連接、轉(zhuǎn)化等基因操作方法構(gòu)建DH5α/p UCP－Red重組菌。

1.4.1.2 PAO1/p UCP－Red菌 株 的 構(gòu) 建 及 篩 選 挑 取PAO1單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，按1∶100轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基，37℃220 r/min快速振搖3 h（OD600約為0.4～0.5）。離心收集菌體沉淀并用10%甘油洗滌4次，按每100 m L培養(yǎng)所得菌體加入100μL 10%甘油重懸，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。取1μg p UCP－Red質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化PAO1感受態(tài)細(xì)胞，電擊條件25μF、200Ω、2.5 k V。電擊后菌液立即轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，180 r/min振搖2 h后，涂布含有羧芐青霉素（300μg/m L）的LB平板，37℃培養(yǎng)24 h～48 h挑取單菌落，采用PCR鑒定質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)化（引物見(jiàn)表1）。

1.4.2 PAO1lasB基因敲除株的構(gòu)建

1.4.2.1 線性打靶片段的制備 線性打靶片段的構(gòu)建參照文獻(xiàn)進(jìn)行［7］。打靶片段前臂、后臂（lasB基因編碼區(qū)上游或下游）和慶大霉素抗性基因引物，見(jiàn)表1。

1.4.2.2 PAO1/p UCP－Red電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備 PAO1/p UCP－Red感受態(tài)的制備參照上述感受態(tài)制備方法和文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

1.4.2.3lasB基因敲除株的篩選 從羧芐青霉素（300μg/mL）和慶大霉素（200μg/m L）雙抗性平板上挑取單菌落經(jīng)培養(yǎng)后，提取基因組DNA，通過(guò)PCR鑒定（引物見(jiàn)表1），篩選發(fā)生正確重組的lasB基因敲除株。

1.4.3lasB基因敲除株的鑒定

1.4.3.1lasB基因轉(zhuǎn)錄情況鑒定 常規(guī)LB培養(yǎng)細(xì)菌后，提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增lasB基因，檢測(cè)該基因的mRNA轉(zhuǎn)錄情況，引物見(jiàn)表1。

1.4.3.2 彈性蛋白酶活性測(cè)定 通過(guò)牛奶平板法，檢測(cè)lasB基因敲除株彈性蛋白酶活性，方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［8］。

2 結(jié) 果

2.1 p UCP－Red質(zhì)粒的構(gòu)建 采用Red FP和Re－d RP引物成功擴(kuò)增了分子量約為3 400 bp的Red重組酶基因（包括exo、beta、gam3個(gè)基因）。p UCPRed質(zhì)粒經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定，所構(gòu)建的red基因核酸序列與理論序列完全一致，PCR結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pUCP－Red中red基因的PCR鑒定M：DL15000 Marker；1，2：red基因PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR analysis of red gene cloned into vector pUCP－Red M：DL15000 Marker；1，2：PCR amplification results of red gene

2.2 線性打靶片段的制備 以PAO1基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出兩端與lasB基因上下游序列同源的80 bp前臂和后臂；以pJQ200SK質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增了835 bp的慶大霉素抗性基因。通過(guò)FAFP和BARP引物，可擴(kuò)增全長(zhǎng)約為1 000 bp的線性打靶片段，如圖2所示，且經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序鑒定，線性打靶序列與理論序列完全一致。

圖2 線性打靶片段的PCR鑒定M：DL15000 Marker；1，2：線性打靶片段的PCR鑒定結(jié)果（FAFP和BARP引物鑒定）Fig.2 PCR analysis of recombinant DNA fragment used for knocking out the lasB gene of PAO1M：DL15000 Marker；1，2：PCR amplification results of recombinant DNA fragment（amplified by FAFP and BARP primers）

2.3lasB基因敲除株的PCR鑒定 若未發(fā)生同源重組的菌株，通過(guò)敲除基因外側(cè)引物JDFP和JDRP（上下游引物分別位于lasB基因－431～－413和＋181～＋199）可從PAO1基因組DNA上擴(kuò)增出約2 130 bp的lasB基因及基因組序列；而發(fā)生正確重組的lasB基因敲除株則可擴(kuò)增出約1 300 bp的線性打靶片段和部分基因組序列。通過(guò)JDFP和JDRP引物PCR鑒定可見(jiàn)，對(duì)照組PAO1、PAO1/p UCP－Red菌株和發(fā)生正確重組的lasB基因敲除株均擴(kuò)增出了與理論相符的DNA序列長(zhǎng)度。此外，通過(guò)線性打靶基因的前臂上引和后臂下引擴(kuò)增出了約1 000 bp的打靶基因DNA序列，從而從分子水平上證明lasB基因成功敲除，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 lasB基因敲除株P(guān)CR鑒定M：DL2000 Marker；1：PAO1野生株（JDFP和JDRP引鑒定）；2 ：PAO1/p UCP－Red（JDFP和JDRP 引 鑒定）；3：lasB 基因敲除株（JDFP和JDRP引鑒定）；4：lasB基因敲除株（FAFP和BARP引物鑒定）Fig.3 PCR results of PAO1 knocked out of lasB geneM：DL2000 Marker；1：PAO1 wild type（amplified by JDFP and JDRP primers）；2：PAO1/p UCP－Red（amplified by JDFP and JDRP primers）；3：lasB gene knocked－out strain （amplified by JDFP and JDRP primers）；4：lasB gene knocked－out strain（amplified by FAFP and BARP primers）

2.4 陽(yáng)性重組菌彈性蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄情況 通過(guò)RT－PCR法鑒定陽(yáng)性重組菌中彈性蛋白轉(zhuǎn)錄情況，未發(fā)現(xiàn)有彈性蛋白酶基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.5lasB基因敲除株的彈性蛋白酶檢測(cè) 彈性蛋白酶能夠降解牛奶平板中的酪蛋白形成透明環(huán)，因此，利用牛奶平板可直觀的檢測(cè)菌株彈性蛋白酶的分泌情況。與PAO1野生株相比，lasB基因敲除株細(xì)菌培養(yǎng)液中未檢測(cè)到彈性蛋白酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

3 討 論

Pa彈性蛋白酶是其最為重要的致病因子之一，它可降解宿主細(xì)胞基質(zhì)分子、各種膠原、肺上皮細(xì)胞表面活性蛋白A和D［9］，其降解產(chǎn)物可抑制內(nèi)源性抗菌物質(zhì)和其它抗菌肽活性［10］。這些研究揭示了彈性蛋白酶在Pa致病性方面的重要性，但其對(duì)Pa自身代謝有何影響？缺乏彈性蛋白酶的Pa對(duì)宿主整體的致病性有何不同？目前對(duì)這些方面尚缺乏系統(tǒng)深入的研究。因此，本研究以獲得無(wú)彈性蛋白酶活性的Pa菌株，為進(jìn)一步研究彈性蛋白酶的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

圖4 彈性蛋白酶編碼區(qū)mRNA的RT－PCR產(chǎn)物電泳圖M：Markers；1：PAO1株彈性蛋白酶編碼區(qū)mRNA的RT－PCR產(chǎn)物；2：lasB基因敲除株彈性蛋白酶編碼區(qū)m RNA的RT－PCR產(chǎn)物Fig.4 RT－PCR products of elastase mRNAM：Markers；Line 1：RT－PCR products of elastase mRNA of PAO1；Line 2：RT－PCR products of elastase mRNA of lasB gene knocked－out strain

圖5 平板法檢測(cè)彈性蛋白酶活性檢測(cè)圖孔1、2：PAO1菌液104/m L×50μL×10 hrs；孔3、4：陽(yáng)性重組菌菌液104/m L×50μL×10 hrsFig.5 Elastase activity measurement by milk plate methodHole 1 and 2：Bacteria culture of PAO1（104/mL×50μL×10 hrs）；Hole 3 and 4：Bacteria culture of lasB gene knocked－out strain（104/m L×50μL×10 hrs）

λ噬菌體的Red重組體系由exo、beta和gam3個(gè)基因組成，分別編碼Exo、Beta和Gam三種酶，其中Exo蛋白是一種核酸外切酶，可結(jié)合于雙鏈DNA的末端，從5′端向3′端降解DNA，產(chǎn)生3′突出端；Beta蛋白可結(jié)合在單鏈DNA上，介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA退火，從而有利于線性片段與同源區(qū)發(fā)生重組置換；Gam蛋白可與細(xì)菌體內(nèi)RecBCD酶結(jié)合抑制其核酸外切酶V活性，從而抑制外源DNA的降解［11－12］。采用Red重組系統(tǒng)進(jìn)行雙臂同源重組的基因敲除，其效率較傳統(tǒng)的依賴于細(xì)菌體內(nèi)固有的同源重組機(jī)制發(fā)生的重組高幾十倍［13］。同時(shí)，在構(gòu)建好線性打靶片段后，從轉(zhuǎn)化到篩選獲得陽(yáng)性重組子，僅需2 d時(shí)間，運(yùn)用該系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除，具有很高時(shí)效性。

文獻(xiàn)報(bào)道及我們的實(shí)驗(yàn)表明，Red重組系統(tǒng)的重組效率與雙臂同源片段的長(zhǎng)度有明顯相關(guān)性，同源片段越長(zhǎng)，重組效率越高。文獻(xiàn)報(bào)道所需同源臂長(zhǎng)為50～100 bp即可滿足重組需求，本研究采用的上、下臂同源片段長(zhǎng)度為80 bp，獲得了較高的重組效率（約80%），而采用該系統(tǒng)進(jìn)行另一PAO1基因組DNA片段定點(diǎn)插入實(shí)驗(yàn)時(shí)，雙臂長(zhǎng)度選擇了400 bp，其重組效率可達(dá)100%。

此外，由于Pa在液體培養(yǎng)中極易分泌胞外粘性物質(zhì)（Extracellular polymeric substances，EPS），影響其感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化效率。因此在制備感受態(tài)時(shí)，為了保證L－阿拉伯糖能充分誘導(dǎo)Red重組酶的表達(dá)且保持較低的菌液粘性物質(zhì)，在菌液剛出現(xiàn)渾濁（OD600約為0.1）時(shí)，即可加入L－阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察菌液及時(shí)終止誘導(dǎo)并制備感受態(tài)（一般1～3h）。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)打靶片段電擊轉(zhuǎn)化，經(jīng)1%L－阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)了Red重組酶的PAO1/p UCP－Red感受態(tài)細(xì)胞，成功篩選到了PAO1的lasB基因敲除株，表明該Red重組體系可有效的運(yùn)用于Pa的基因修飾。

同時(shí)，因p UCP質(zhì)粒能在如大腸桿菌等多種革蘭氏陰性菌中進(jìn)行復(fù)制，本研究所構(gòu)建的p UCPRed質(zhì)粒還可用于這些菌株的基因敲除、定點(diǎn)突變、基因敲入等多種基因修飾中，但其效果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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