王 歡，張潤祥，李 迪，曹永生，高明春，王君偉

口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease，F(xiàn)MDV）引起的急性，高度接觸性傳染病，主要感染偶蹄家畜，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴(yán)重威脅。FMDV是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員，有7種血清型，分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3以及 Asia1型，型間無交叉免疫保護(hù)［1］。

由于ELISA的檢測抗原、操作形式等各有不同，因此其敏感性和特異性存在一定差異，實(shí)際應(yīng)用中需要對這些方法進(jìn)行客觀的比較評價(jià)，國外對NSP－ELISA 的評估進(jìn)行了多篇報(bào)道［2－4］，泛美口蹄疫中心（PANAFTOSA）和英國Pirbright實(shí)驗(yàn)室分別制作了評價(jià)各種方法的牛源血清盤，而國內(nèi)尚無對?？谔阋逳SP－ELISA的評價(jià)報(bào)告。

ROC曲線（receiver operating characteristic curve）分析被認(rèn)為是一種試驗(yàn)評價(jià)中的理想和經(jīng)典方法［5］，是將檢測結(jié)果劃分為若干臨界點(diǎn)，以每個(gè)臨界點(diǎn)對應(yīng)的敏感性為縱坐標(biāo)，“1－特異性”為橫坐標(biāo)，作圖得到的曲線，可以比較直觀的看出敏感性與特異性之間的關(guān)系，通過計(jì)算ROC曲線下面積（Area Under the ROC，AUC）來評價(jià)診斷方法的準(zhǔn)確性，是一種全而、準(zhǔn)確評價(jià)診斷試驗(yàn)的有效工具［11］。本研究以世界公認(rèn)的商品化試劑盒Ceditest?ELISA為參考標(biāo)準(zhǔn)，對國內(nèi)3種商品化ELISA試劑盒和實(shí)驗(yàn)室建立的8BF－ELISA方法［6］運(yùn)用ROC曲線對4種ELISA方法進(jìn)行綜合性評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)血清 用Ceditest?ELISA作為檢測標(biāo)準(zhǔn)，批號(hào)：07K570，164份血清來源于2個(gè)已知感染過FMD的且痊愈的牛場，其中85份陽性，79份陰性。

1.2 4種ELISA試劑盒 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測ELISA試劑盒，（以下簡稱ELISA A）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)：2008022608；口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA試劑盒，（以下簡稱ELISA B）由北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：CB2008031201；3B合成肽ELISA試劑盒，（以下簡稱ELISA C）由上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)；200806023；由本實(shí)驗(yàn)室建立的8BF－ELISA方法，（以下簡稱ELISA D）［13］。

1.3 結(jié)果判定 ELISA A臨界值＝（OD樣品－OD陰性）/（OD陽性－OD陰性），其臨界值小于0.2，為陰性；大于0.3為陽性；在0.2－0.3之間為可疑，可疑樣品進(jìn)行復(fù)測如果大于0.2為陽性；ELISA B臨界值＝（陰性對照孔OD均值－樣品孔OD均值）/陰性對照孔OD均值＊100%

被檢樣品阻斷率（Inh%）大于等于40%為抗體陽性；在25%－40%之間為可疑；小于25%為陰性；ELISA C臨界值＝0.23＊陽性對照孔平均OD值；ELSIA D臨界值判定同ELISA A。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用EXCEL2007和PASW/SPSS Statistics18聯(lián)合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過對ROC曲線下面積（AUC）大小和Youden指數(shù)［7］分析，來確定ELISA檢測方法陽性判定結(jié)果的準(zhǔn)確性和最適臨界值，評價(jià)4種ELISA檢測方法的檢測能力。

2 結(jié) 果

2.1 4種ELISA檢測方法對試驗(yàn)樣本的檢測結(jié)果4種ELISA方法的檢測結(jié)果見表1，因?yàn)镋LISA A B D均設(shè)有可疑區(qū)間，進(jìn)行復(fù)測后把ELISA－A和D的臨界值設(shè)為0.2，ELISA B設(shè)為0.25，4種ELISA 方 法 的 檢 出 率 （Ef）分 別 為95.12%，89.02%，84.76%，93.29%。經(jīng)X2檢驗(yàn)，ELISA C的檢出率低于其他3種檢測方法，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.006＜0.01），其他3種ELISA方法的檢出率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.099＞0.05）。

表1 4種ELISA方法對確定血清FMDV－NSP抗體的檢測結(jié)果Tab.1 Four ELISA methods for determination of serum FMDV－NSP antibody test results

4種ELISA檢測方法的敏感性分別為96.47%（82/85），95.29% （81/85），70.59% （60/85），92.94%（79/85）；特異性分別為93.67%（74/79），82.28%（65/79），100.00%（79/79），93.67%（74/79）。

2.2 應(yīng)用ROC曲線分析 見圖1，曲線起始部分上升較陡，表明試驗(yàn)分辨率較精確；并且4種ELISA的ROC曲線均在參考線以上，并遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)線，且?guī)追N方法相應(yīng)的ROC曲線非常接近。曲線下的面積見表2，根據(jù)Swets［8］判斷規(guī)則，面積越大，判斷越有效；面積越小，判斷價(jià)值越低。其中面積在0.5以下者試驗(yàn)沒有診斷價(jià)值，面積在0.5～0.7之間有較低的準(zhǔn)確性，面積在0.7～0.9之間有一定的準(zhǔn)確性，在0.9以上者，則有較高的準(zhǔn)確性ROC面積在0.937～0.982之間，表明4種方法都有很高的準(zhǔn)確性。比較4種ELISA方法的ROC曲，線下面積（AUC），差異均不顯著。

2.3 確定最佳臨界值 以圖1的ROC曲線上的各切點(diǎn)作為閾值，計(jì)算相應(yīng)的敏感性、特異性及Youden指數(shù)。Youden指數(shù)是分析敏感性和特異性的綜合評價(jià)指標(biāo)，可以避免對于敏感性和特異性的偏移，能較客觀的反映實(shí)際情況。從圖2中可明顯看出Youden指數(shù)和試驗(yàn)檢出率呈正相關(guān)的關(guān)系，并且在某一臨界值附近有相同的波峰，說明在這一臨界值附近有著很好的檢測能力。

圖1 4種ELISA方法對FMDV－NS抗體檢測結(jié)果的ROC曲線Fig.1 ROC curves of the four ELISAs for detection of FMDV－NSP antibodies

表2 曲線下的面積Tab.2 Area under the curve

圖2 在不同臨界值下，試驗(yàn)檢出率與Youden指數(shù)的變化情況Fig.2 Detection rates and Youden index changes in the different threshold

圖2中的Youden指數(shù)，對應(yīng)的切點(diǎn)為ROC曲線上的最佳臨界值，表3給出了四種ELISA方法在最佳臨界值時(shí)的敏感性、特異性和檢出準(zhǔn)確率的比較。從表3能明顯看出在ROC曲線下應(yīng)用最佳臨界值來檢測FMDV－NSP抗體要比使用制造商推薦的臨界值時(shí)的檢測準(zhǔn)確率要高，且4種方法的準(zhǔn)確率之間無顯著性差異（P＝0.461＞0.05）。

表3 四種ELISA在最佳臨界值時(shí)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性Tab.3 Sensitivity，specificity and accuracy of the four ELISAs based on the optimization of the cut－off

3 討 論

2006年－2008年6個(gè)國家科學(xué)家通過對已知陰陽性血清檢測［9］，通過和3種商品化試劑盒，國際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）參考方法（NCPanaftosascreening）及意大利室內(nèi)質(zhì)控方法（3ABC trapping－ELISA）進(jìn)行ROC曲線和極大似然值法［17］，貝葉斯定律［10－11］等方法的全面比較分析評價(jià)：在商品化試劑盒中，Ceditest?ELISA的敏感性和特異性最優(yōu)，檢測結(jié)果接近OIE參考方法。因此本研究選擇了Ceditest?ELISA作為試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對國內(nèi)幾種NSP－ELISA進(jìn)行了比較評價(jià)。表1可看出，ELISA C的相對特異性為100%，但敏感性只有70%，而ELISA A敏感性和特異性都超過了90%，但在臨界值＞＝0.3時(shí)特異性為98.7%，敏感性為89.2%；ELISA B在抑制率為40%時(shí)，敏感性和特異性分別77.6%和98.7%；ELISA D在臨界值為0.3時(shí)特異性和敏感性分別為97.4%和83.5%。但經(jīng)過ROC分析，用Youden指數(shù)結(jié)合敏感性和特異性給出另一臨界值時(shí)，4種檢測方法的敏感性和特異性趨于平衡，檢測準(zhǔn)確率都有所增加。4種方法有3種都設(shè)有可疑區(qū)間，可以通過對可疑區(qū)間的復(fù)測來增加檢驗(yàn)準(zhǔn)確率，所以，在ELISA方法的建立過程中確保一定的可疑區(qū)間是比較科學(xué)的。

用ROC分析ELISA方法的檢測能力，國內(nèi)在獸醫(yī)研究方面的文獻(xiàn)相對較少。在本研究中，ROC分析ELISA A給出最大的AUC（見表2），要比其他3種方法稍微高一點(diǎn)，但其他三種方法的AUC也都超過了0.9，表明其他3種ELISA方法檢測能力也是比較好的，只是ELISA C的檢測敏感性略低，不太適合做大規(guī)模臨床樣本的檢測，但特異性較高可作為臨床樣本的確診試驗(yàn)。綜合評估，在優(yōu)化臨界值后的ELISA A，ELISA B和ELISA D的敏感性和特異性都大于90%，均可用于大規(guī)模臨床樣本的初篩試驗(yàn)。

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