陳燕杰，裴亞玲，吳 華，潘玉善，劉建華，苑 麗，杜向黨，孟春萍，胡功政

2.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校，鄭州 450011

氨基糖苷類抗生素是治療鴨大腸桿菌病的常用藥物，近年來已陸續(xù)有鴨源大腸桿菌對本類藥物耐藥的研究報道［1］。氨基糖苷類修飾酶是腸桿菌對氨基糖苷類產(chǎn)生耐藥性的重要原因。2003年，一種較新的由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制—16S r RNA甲基化酶被發(fā)現(xiàn)，其可導(dǎo)致革蘭氏陰性桿菌對氨基糖苷類藥物高度耐藥［2］。目前，已有6種16S r RNA甲基化酶基因在醫(yī)學(xué)臨床上相繼報道，包括arm A、rmt A、rmt B、rmtC、rmt D和nmp A等［2－5］，可導(dǎo)致對幾乎所有臨床重要的氨基糖苷類抗生素的高水平耐藥性［6－7］。16S r RNA 甲基化酶基因通常有質(zhì)粒介導(dǎo)，能通過接合或轉(zhuǎn)化進(jìn)行傳播和擴(kuò)散［8］，且與可移動基因元件（插入序列、轉(zhuǎn)座子）相關(guān)［9］?，F(xiàn)已有人源、豬源、雞源大腸桿菌中檢測氨基糖苷類修飾酶基因的報道［10－11］，但迄今，對鴨源大腸桿菌氨基糖苷類耐藥機(jī)制的報道相對較少，有關(guān)鴨源大腸桿菌16S r RNA甲基化酶基因的檢測尚未見報道。本試驗旨在檢測分析氨基糖苷類修飾酶基因和16S r RNA甲基化酶基因及其基因環(huán)境，探討耐藥基因與耐藥表型的相關(guān)性、耐藥基因的傳播擴(kuò)散機(jī)制，為鴨大腸桿菌病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 保存鴨源大腸桿菌27株，2009年5月—2010年10月由本試驗室從湖南、四川、江西、福建、山東、河南等地的病死鴨肝臟、心臟中分離，經(jīng)培養(yǎng)特性、全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定為大腸桿菌。大腸桿菌C600為質(zhì)粒接合受體菌。

1.2 試驗藥品 慶大霉素（GM）、安普霉素（AM）、新霉素（NM）、硫酸阿米卡星（AMK）：均由河南牧翔動物藥業(yè)有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)基和試劑 MH肉湯、LB肉湯均購置廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；QIAGEN Plasmid MiniKit（QIAGEN公司），Taq Mix DNA（北京康為世紀(jì)有限公司）聚合酶、PCR試劑、DNA Markers，T4DNA連接酶、EcoRI均購自TaKaRa公司，瓊脂糖，購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

1.4 主要儀器 PCR儀，法國生物梅里埃VITEK－32全自動細(xì)菌鑒定儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，電子分析天平，超凈工作臺，EBA21離心機(jī)，高壓滅菌鍋，恒溫水浴搖床，96孔V型反應(yīng)板等。

1.5 載體 p BluescriptⅡSK（＋）（本校微生物實驗室惠贈）。

1.6 藥敏試驗 用試管二倍微量稀釋法，測定氨基糖苷類代表藥物慶大霉素、安普霉素、新霉素、阿米卡星對臨床分離菌株的最低抑菌濃度（MIC）［12］。

1.7 氨基糖苷類耐藥基因的檢測 根據(jù)Gene－Bank公布的有關(guān)序列設(shè)計6對特異性引物，擴(kuò)增arm A、rmt A、rmtB、rmtC、rmtD和npm A基 因，見表1。采用煮沸法提取DNA。反應(yīng)體系：模板3 μL，25μmol/m L的上下游引物各1μL，雙蒸水20 μL，Taq Mix DNA聚合酶25μL，總體積為50μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，其中arm A和npm A的Tm＝52℃，rmt A和rmt D為63℃，rmt B為61 ℃，rmtC為56.5 ℃，72 ℃ 延 伸8 min。

另按文獻(xiàn)報道的引物和條件擴(kuò)增氨基糖苷類修飾酶基因［13］aac（3）－I、aac（3）－II、aac（3）－III、aac（3）－IV、ant（2’’）、aph A1、aph A2。

以滅菌雙蒸水為陰性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。代表性PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果在NCBI BLAST上進(jìn)行同源性分析。

1.8 質(zhì)粒接合試驗 以5株16S甲基化酶基因陽性的分離菌為供體菌，利福平耐藥的大腸桿菌C600為受體菌，各取0.5 m L接種到5m L LB肉湯中混勻，37℃震蕩培養(yǎng)5 h。以受體菌、供體菌為對照，在含利福平（300μg/m L）和阿米卡星（128μg/m L）的LB平板上篩選陽性接合子。按前述方法測定接合子的MIC、檢測16S r RNA甲基化酶基因。

用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒提取供體菌與接合子質(zhì)粒，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳，以大腸桿菌V517作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒Marker，用LambImage軟件計算質(zhì)粒大小，分析質(zhì)粒輪廓（數(shù)量和大?。?/p>

1.9rmt B的基因環(huán)境

1.9.1 p BluescriptⅡSK（＋）－rmtB重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別將兩株接合子菌株CY1、CY2質(zhì)粒和載體p BluescriptⅡSK（＋）質(zhì)粒用EcoRI單酶切，兩者酶切產(chǎn)物按1∶2進(jìn)行粘末端連接反應(yīng)。構(gòu)建的p BluescriptⅡSK（＋）－rmtB重組質(zhì)粒，CaCl2法克隆到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用 LB/Amp/AMK/X－gal/IPTG平板篩選陽性重組子，增菌后提取重組質(zhì)粒。1.9.2 重組質(zhì)粒的確認(rèn)、靶基因的測序及分析 用EcoR I單酶切重組質(zhì)粒，后1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以確證靶基因的正確插入及測定插入片段的大小。陽性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司用M13通用引物Primer Walking測序，把所得序列在NCBI進(jìn)行Blast比對，并用DNAStar軟件作同源性分析。

表1 PCR擴(kuò)增及測序所用引物Tab.1 Primers used for the PCR amplification and sequencing

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗 敏感性試驗結(jié)果見表2，27株分離鴨源大腸桿菌中分別有23、19、19和18株對安普霉素、慶大霉素、阿米卡星、新霉素耐藥，耐藥及交叉耐藥十分嚴(yán)重。

2.2 耐藥基因的檢測 16S甲基化酶基因 27株鴨源大腸桿菌中，rmt B基因陽性19株，檢出率為70.4%，未擴(kuò)出arm A、rmt A、rmtC、rmt D和npm A基因。rmt B基因與已報道的rmt B基因（JF910132.1）同源性達(dá)99%以上。序列測定結(jié)果已經(jīng)登陸GenBank，并獲得相應(yīng)的序列號：JN387906。

氨基糖苷類修飾酶基因 僅6株檢測出aac（3）－Ⅳ，檢出率為22.2%。PCR產(chǎn)物所測序列（序列號：JN387905），與 GenBank：HQ380033.1同源性達(dá)95%以上。這6株同時攜帶aac（3）－Ⅳ和rmtB基因。

表2 27株分離菌的耐藥表型Tab.2 Resistance phenotypes of 27 isolates

2.3 質(zhì)粒接合試驗 獲得的5株接合子，全部檢測出rmt B的陽性條帶，均對4種氨基糖苷類藥物高水平耐藥（MIC≥128）。說明rmtB基因和對氨基糖苷類高水平耐藥性可由質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移。

2.4 質(zhì)粒輪廓分析 供體菌Y1、Y2分別有4個、2個質(zhì)粒傳遞給對應(yīng)的接合子CY1、CY2，質(zhì)粒大小從3 kb到108 kb不等。Y1菌株有3個可見質(zhì)粒，質(zhì)粒數(shù)少于接合子CY1，可能是由于質(zhì)粒提取過程DNA發(fā)生降解。

2.5 rmtB的基因環(huán)境 將陽性重組質(zhì)粒p BluescriptⅡSK（＋）－rmtB用EcoR I單酶切后電泳，可見約4.5 kb的rmt B及其上下游目的片斷（圖1），載體片段為2 918 bp。測序后所得rmt B基因環(huán)境示意圖見圖2：rmtB上游是β－內(nèi)酰胺酶編碼基因blaTEM－1，下游為ISCRI轉(zhuǎn)座酶基因。序列測定結(jié)果已經(jīng)登陸GenBank，并獲得相應(yīng)的序列號：JQ941741。

3 討 論

以往認(rèn)為，細(xì)菌對氨基糖苷類藥物耐藥的主要機(jī)制是由于3種氨基糖苷修飾酶即磷酸化酶（aph）、乙?；福╝ac）、腺苷化酶（ant）所產(chǎn)生。每種修飾酶又分為多種同工酶及其亞型，各亞型有不同的耐藥表型，相同的表型還可由不同的基因編碼［13］。但這些酶由于特異性的窄底物譜，其中任何一種都不能賦予細(xì)菌對所有氨基糖苷類藥物的耐藥性。據(jù)報道在耐氨基糖苷類的臨床分離菌中，aac編碼的耐藥性約為5%～10%［11］。本試驗中，aac（3）－Ⅳ基因是國內(nèi)鴨源大腸桿菌中的首次檢出。aac（3）－Ⅳ首先發(fā)現(xiàn)于人源耐慶大霉素的菌株中，主要編碼對慶大霉素的抗藥性，但不能導(dǎo)致對阿米卡星的明顯耐藥。aac（3）－Ⅳ的檢出率僅為22.2%，遠(yuǎn)低于本類藥物耐藥率，顯然aac（3）－Ⅳ并不是主要的耐藥機(jī)制。

圖1 pBluescriptⅡSK（＋）－rmtB重組質(zhì)粒酶切結(jié)果M：DNA MarkerλEco T14Ⅰdigest；1：重組質(zhì)粒pBluescrlptⅡSK（＋）－rmtB的EcoR I單酶切片段；2：載體pBluescrlptⅡSK（＋）的EcoR I單酶切片段；3：陰性對照.Fig.1 Digestation results of pBluescriptⅡSK（＋）－rmtB recombinant plasmidM：DNA MarkerλEco T14Ⅰdigest；1：Recombinant plasmid pBluescrlpt II SK（＋）－rmt B single fragment with EcoR I；2：pBluescrlpt II SK （＋）single fragment with EcoR I；3：Negative control.

圖2 rmtB環(huán)境結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of rmtB environment

新出現(xiàn)的本類藥物如阿米卡星經(jīng)過功能基團(tuán)的修飾，過去報道耐藥率低［14］。但本次試驗表明：鴨源大腸桿菌對其耐藥率很高（70.4%），這可能與其在鴨病防治中長期不規(guī)范使用有關(guān)（該藥在獸醫(yī)臨床并未批準(zhǔn)使用）。本試驗中rmt B基因的檢出率（70.4%）與對阿米卡星的高耐藥率一致，明顯高于aac（3）－Ⅳ的檢出率，說明rmt B基因在鴨源大腸桿菌中更為流行，阿米卡星的高耐藥率顯然主要與rmt B有關(guān)。27株鴨大腸桿菌中，6株攜帶aac（3）－Ⅳ基因的菌株均同時攜帶rmtB基因，因本次試驗所選菌株較少，故只能代表部分地區(qū)新耐藥基因的流行和多耐藥基因的同時存在，是導(dǎo)致對氨基糖類高水平耐藥和嚴(yán)重交叉耐藥的重要原因。但分離菌對安普霉素的耐藥率高于rmtB的檢出率，說明仍存在其它耐藥機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

細(xì)菌借助可移動遺傳元件（質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等），通過水平轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因［15］。質(zhì)粒接合是基因轉(zhuǎn)移的重要過程，多數(shù)致病菌獲得耐藥性是通過接合完成的。本研究中，5株接合子都能檢出可接合質(zhì)粒和rmtB基因，并對四種藥物呈高水平耐藥，說明5株菌的rmt B均可通過質(zhì)粒接合傳遞給受體菌，并使受體菌高水平耐藥，導(dǎo)致高水平耐藥性的傳播和擴(kuò)散。rmt B的上游是可介導(dǎo)對氨芐西林、阿莫西林耐藥的blaTEM－1，下游是插入序列ISCRI，這表明blaTEM－1與rmt B位于同一質(zhì)粒上，其接合傳遞可同時引起對氨基糖苷類、廣譜青霉素類耐藥的傳播擴(kuò)散，此外，下游的ISCRI在rmt B傳播擴(kuò)散中有重要作用。質(zhì)粒的可傳遞性給耐藥性傳播的阻斷和畜禽疾病的防治帶來很大困難，故應(yīng)進(jìn)一步了解細(xì)菌群體中耐藥質(zhì)粒的分布狀況，找出流行質(zhì)粒并分析其分子特點，為有效地控制、預(yù)防耐藥質(zhì)粒的流行傳播奠定基礎(chǔ)。

［1］Yu XH，Chen Y，Yang XN，et al.Investigation on resistance phenotype and resistance gene aaC2 against aminoglycoside antibiotics in 64 strains of pathogenicE.colifrom ducks［J］.China Anim Husbandry Vet Med，2010，37（11）：39－43.（in Chinese）

于學(xué)輝，陳穎，楊曉農(nóng)，等.64株鴨致病性大腸桿菌氨基糖苷類藥物耐藥表型及aaC2耐藥基因的調(diào)查［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（11）：39－43.

［2］Yokoyama K，Doi Y，Yamane K，et al.Acquisition of 16S r RNA methylase gene inPseudomonasaeruginosa［J］.Lancet，2003，362（9399）：1888－1893.DOI：10.1016/S0140－6736（03）14959－8

［3］Wachino J，Yamane K，Shibayama K，et al.Novel plasmid－mediated 16S r RNA methylase，RmtC，found in a proteusm mirabilis isolate demonstrating extraordinary high－level resistance against various aminoglycosides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（1）：178－184.DOI：10.1128/AAC.50.1.178－184.2006

［4］Doi Y，de Oliveira Garcia D，Adams J，et al.Coproduction of novel 16S r RNA methylase RmtD and metallo－beta－lactamase SPM－1 in a panresistantPseudomonasaeruginosaisolate from Brazil［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（3）：852－856.DOI：10.1128/AAC.01345－06

［5］Doi Y，Yokoyama K，Yamane K，et al.Plasmid－mediated 16S r RNA methylase inSerratiamarcescensconferring high－level resistance to aminoglycosides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（2）：491－496.DOI：10.1128/AAC.48.2.491－496.2004

［6］Wachino J，Shibayama K，Kurokawa H，et al.Novel plasmidmediated 16S r RNA mlA1408 methyltransferase，Npm A，found in a clinically isolatedEscherichiacolistrain resistant to structurally diverse aminoglycosides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（12）：4401－4409.DOI：10.1128/AAC.00926－07

［7］Yamane K，Doi Y，Yokoyama K，et al.Genetic environments of the rmt A gene inPseudomonasaeruginosaclinical isolates［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（6）：2069－2074.DOI：10.1128/AAC.48.6.2069－2074.2004

［8］Chen L，Chen ZL，Liu JH.Novel resistance mechanism of aminoglycosides in Gram－negative bacilli：a review of 16 S r RNA methylase［J］.Vet Sci China，2006，36（11）：935－939.（in Chinese）

陳琳，陳杖榴，劉健華.氨基糖苷類藥物耐藥新機(jī)制－16S r RNA甲基化酶的研究進(jìn)展［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（11）：935－939.

［9］Yamne K，Wachino J，Doi Y，et al.Global spread of multiple aminoglycoside resistance genes［J］.Emerg Infect Dis，2005，11（66）：951－953.DOI：10.3201/eid1106.040924

［10］Cai PQ，Wang CX，Zhao Q，et al.Detection of aminoglyco－sides－modifying enzymes gene in gram－negative bacilli［J］.Mod Pract Med，2004，16（6）：326－328.（in Chinese）

蔡培泉，王春新，趙琪等.革蘭陰性桿菌9種氨基糖苷類修飾酶基因的檢測［J］.現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2004，16（6）：326－328.

［11］Zhang X，Tang XB，Wu B，et al.Analysis of multi－drug resistance and the resistance genes to aminoglycoside antibiotics of extraintestinal pathogenicEscherichiacoli［J］.Chin J Antibiotics，2009，34（8）：498－504.（in Chinese）

張璇，湯細(xì)彪，吳斌，等.腸外致病性大腸埃希菌多重耐藥性及氨基糖苷類耐藥基因分析［J］.中國抗生素雜志，2009，34（8）：498－504.

［12］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2010.

［13］Wolf E，Vassilev A，Makino Y，et al.Crystal structure of a GCN5－related N－acetyltransferase：Serratiamarcescensaminoglycoside 3－N－acetyltransferase［J］.Cell，1998，94（4）：439－449.DOI：10.1016/S0092－8674（00）81585－8

［14］Shi WF，Jiang JP，Mi ZH.Relationship between antimicrobial resistance and aminoglycoside modifying enzyme gene expressions inAcinetobacterbaumannii［J］.Chin Med J，2005，118（2）：141－145.

［15］Tenover FC.Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria［J］.Am J Med，2006，119（6 Suppl 1）：S3－S10.DOI：10.1016/j.amjmed.2006.03.011