榮立新，魯 爽，劉詠梅

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

北沙參為傘形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis Fr.Schmidt exMiq.)的干燥根，有養(yǎng)陰清肺、益胃生津的功效。研究表明，多糖是其中主要成分，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［1，2］。本實(shí)驗(yàn)觀察了北沙參粗多糖(GLP)［1］對(duì)陰虛小鼠的免疫調(diào)節(jié)現(xiàn)象，以揭示其滋陰作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，并進(jìn)一步探討中藥的陰陽平衡理論。

1 材料

小牛血清(杭州四季青生物材料公司)，甲狀腺素(萊陽生物化學(xué)制藥廠)，利血平(上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠)，PRMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó) Gibco公司)，所用試劑均為分析純。J2-MC BECKMAN高速冷凍離心機(jī)(Bechman公司)，S22PC分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)，HHS型電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏凱儀器廠)。昆明種雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20±2g(濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)魯動(dòng)環(huán)字200007001號(hào))。

2 方法與結(jié)果

2.1 GLP的提取

稱取加工后的北沙參根250 g，加蒸餾水1500 ml，浸泡30 min，回流提取5 h，抽濾、濾液加95%乙醇至含醇量達(dá)50%，靜置過夜，傾出上清液，離心5 min，用50%乙醇洗滌(100 ml×3)，50℃烘箱烘干，過30目篩，得乳白色GLP粗制品［3］。

將制得的GLP粗品加水溶解用三氯乙酸法去游離蛋白質(zhì)，然后置透析袋透析2 d，換水2次去小分子雜質(zhì)，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌、離心，置50℃烘箱烘干，過30目篩，得白色GLP。

2.2 GLP的含量測(cè)定

用硫酸-蒽酮法測(cè)得GLP含量為63.88%。

2.3 動(dòng)物分組及給藥

小鼠40只隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為正常對(duì)照組［生理鹽水20 ml/(kg·d)］、模型對(duì)照組、GLP高劑量組［800 mg/(kg·d)］、GLP 中劑量組［600mg/(kg·d)］、GLP 低劑量組［400 mg/(kg·d)］。每日上午除正常對(duì)照組灌服生理鹽水外，其余各組均灌胃給予甲狀腺片150 mg/kg和利血平1 mg/kg，下午GLP各劑量組分別灌胃給予受試藥物，連續(xù)6d，各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前后各稱體質(zhì)量以計(jì)算體質(zhì)量增加值并觀察其外觀變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采取兩均數(shù)比較t檢驗(yàn)。

2.5 GLP滋陰作用的整體效應(yīng)觀察

小鼠給予甲狀腺素和利血平造模4d后，開始出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、身體瘦長(zhǎng)、躁動(dòng)不安，有的出現(xiàn)兩眼不張、行動(dòng)遲緩甚至死亡。GLP各劑量組動(dòng)物各種虛象較輕;正常對(duì)照組動(dòng)物外觀和行為均正常。

表1顯示，模型組動(dòng)物體質(zhì)量增加值明顯低于正常對(duì)照組，GLP各劑量組的體質(zhì)量增加顯著高于模型組(P＜0.01，P＜0.05)，表明陰虛動(dòng)物體質(zhì)量降低，而GLP能顯著增加其體質(zhì)量且呈劑量關(guān)系，其中GLP高劑量組接近正常水平。

2.6 GLP對(duì)模型小鼠脾臟NK殺傷活力影響

2.7 GLP對(duì)模型小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

表1顯示，將各組小鼠給藥后第7天處死，取脾臟組織制備脾細(xì)胞懸液，參照文獻(xiàn)［4］采用MTT比色方法檢測(cè)各組小鼠刺激指數(shù)(SI)。結(jié)果小鼠造模后，其刺激指數(shù)明顯降低(P＜0.01)，GLP高、中劑量組對(duì)陰虛小鼠的脾臟T細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能均有顯著增強(qiáng)作用(P＜0.01，P＜0.05)，接近正常水平。

2.8 GLP對(duì)模型小鼠血清抗綿陽紅細(xì)胞抗體IgM，IgG含量的影響

將各組小鼠給藥后第7天處死，取小鼠血清，參照文獻(xiàn)［4］采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)抗綿羊紅細(xì)胞抗體IgM、IgG的含量。

表1顯示，陰虛模型小鼠血清IgM，IgG抗體水平與正常組比較明顯降低(P＜0.05)，北沙參多糖的中劑量和低劑量組對(duì)IgM抗體的生成有顯著增強(qiáng)作用(P＜0.05)，北沙參多糖高劑量組和低劑量組則對(duì)IgG抗體的產(chǎn)生有顯著增強(qiáng)作用(P＜0.05)。

表1顯示，將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于給藥后第7天處死，取脾臟組織制備脾細(xì)胞懸液，參照文獻(xiàn)［4］采用MTT比色法檢測(cè)各組小鼠NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率(%)。結(jié)果模型小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷活力明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01)，GLP高劑量組可顯著提高陰虛小鼠的NK殺傷率(P＜0.05)，接近正常值。

表1GLP干預(yù)對(duì)各組小鼠體質(zhì)量變化和各項(xiàng)免疫功能指標(biāo)的影響(±s)

表1GLP干預(yù)對(duì)各組小鼠體質(zhì)量變化和各項(xiàng)免疫功能指標(biāo)的影響(±s)

注:與模型組比較:＊＊P ＜0.01，*P＜0.05

組別 例數(shù) 給藥劑量/(mg/kg)體質(zhì)量增加值/g NK細(xì)胞殺傷率(%)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù) IgM(lgR) IgG(lgR)正 常 對(duì) 照 組 8 5.25±1.04＊＊ 30.01±0.05＊＊ 2.30±0.58＊＊ 4.10±0.02* 2.20±0.02*陰 虛 模 型 組 8 2.57±1.07 18.73±0.03 1.08±0.15 3.60±0.04 1.80±0.02模型 +GLP高劑量組 7 800 4.71±1.11＊＊ 27.52±0.44＊＊ 1.67±0.36＊＊ 4.05±0.03 2.20±0.3*模型 +GLP中劑量組 8 600 3.75±0.89* 22.10±0.09 1.46±0.32＊＊ 3.35±0.05* 1.95±0.05模型 +GLP低劑量組 7 400 3.43±1.40 20.47±0.17 1.03±0.18 3.15±0.03* 2.00±0.04*

3 討論

北沙參屬常用補(bǔ)陰藥，多用于陰虛肺熱等癥，具有補(bǔ)虛扶正祛邪的功效。文獻(xiàn)記載北沙參可增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫［6～8］。采用甲狀腺素和利血平誘導(dǎo)建立小鼠甲亢陰虛證模型，具有方法簡(jiǎn)便、成功率高、死亡率低、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是深入研究陰虛病因機(jī)理的常用動(dòng)物模型制作方法［9，10］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠造模后，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、身體瘦長(zhǎng)、躁動(dòng)不安等現(xiàn)象，符合中醫(yī)陰虛證的臨床表現(xiàn)，說明本實(shí)驗(yàn)塑造的陰虛動(dòng)物模型是成功的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物處于陰虛狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能指標(biāo)均有不同程度的降低，表明由甲狀腺素和利血平所誘發(fā)引起的小鼠陰虛癥的發(fā)病機(jī)制，與機(jī)體免疫功能有著內(nèi)在、直接的聯(lián)系，由陰虛引起的各項(xiàng)病理變化，有可能是通過降低機(jī)體的免疫功能而引發(fā)的。本研究結(jié)果顯示，GLP可顯著提高陰虛小鼠的NK殺傷率(P＜0.05)和血清IgM和IgG含量，對(duì)脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能均有顯著促進(jìn)作用(P＜0.01或P＜0.05)。表明GLP對(duì)陰虛小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有顯著增強(qiáng)作用。提示北沙參對(duì)陰虛癥的治療作用，可能與其中的多糖成分參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，從而使失調(diào)的功能恢復(fù)至正常生理平衡狀態(tài)有關(guān)。其具體調(diào)節(jié)作用機(jī)制及其他成分對(duì)免疫功能是否也有調(diào)節(jié)作用，尚有待進(jìn)一步研究［11］。

［1］石俊英，李寶國(guó)，牟彩萍.山東地產(chǎn)藥材北沙參多糖含量測(cè)定［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，26(2):139-142.

［2］譚允育，康娟娟，王娟娟.沙參對(duì)正常小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22(6):39-44.

［3］屠鵬飛，徐國(guó)鈞，徐珞珊，等.沙參類的研究Ⅲ.多糖的含量測(cè)定［J］.中草藥，1992，23(7):355-366.

［4］司傳平.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:7-53.

［5］李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991:272.

［6］李儀奎，姜名瑛.中藥藥理學(xué)［M］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1992:180.

［7］呂方軍，葉國(guó)華，許一平，等.北沙參莖葉提取液對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(4):936-937.

［8］馮蕾，楊憲勇，冀海偉，等.北沙參超臨界二氧化碳萃取物對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響及成分分析［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(20):1740-1742.

［9］付曉伶，方肇勤.陰虛證動(dòng)物模型的造模方法及評(píng)析［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，18(2):51-54.

［10］王祎媛，侯連兵，蔡鴻福，等.甲狀腺素和利血平誘導(dǎo)小鼠甲亢陰虛證模型的制備［J］.藥物研究，2010，19(23):19-20.

［11］劉詠梅，劉波，王金鳳，等.北沙參粗多糖的提取及對(duì)陰虛小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2005，7:224-225.