齊 峰，邱昌龍，朱 亮，趙 舒，楊小溪

(河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063000)

糖尿病累及周圍神經(jīng)系統(tǒng)可產(chǎn)生糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy DPN)，而且可隨病程的延長而加重，是糖尿病致殘、致死的主要原因之一［1］。黃芪桂枝五物湯是我們臨床常用的治療DPN基本處方之一，且近年來因其療效確切而屢見報(bào)道［2～5］。為進(jìn)一步探明其作用效果和機(jī)制，我們開展了如下研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

8周齡健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220g(SCXK(京)2011-0005)，由河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購。

1.2 藥物

黃芪桂枝五物湯:黃芪15g，桂枝 15g，白芍15g，生姜30g，大棗4枚(15g)組成，成人每日處方生藥量為 90g。藥材加水 300ml，浸泡 30min，煎30min，二煎加水200ml，煎20min，將2次煎汁混勻，水浴濃縮為165%(1ml含1.65g生藥)的藥液，4℃保存?zhèn)溆?。所需藥材從北京同仁堂唐山分部一次性購買;彌可保片(080626)500ug/，日本衛(wèi)材(中國)藥物有限公司。

2.2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(STZ):sigma公司產(chǎn)品(lg/瓶，批號(hào)S0130);NGF(免疫組化試劑盒)，北京博奧森生物科技公司;JT502N電子天平:上海倫捷;SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器:上海亞榮生化儀器廠。

1.3 溶液配置

檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH值4.2～4.5)的配置:取2.1g檸檬酸加入雙蒸水100ml配成A液，取2.94g檸檬酸鈉加入雙蒸水100ml配成B液。用時(shí)將A、B液按1∶1.32比例混合，pH計(jì)測(cè)定pH值，調(diào)節(jié)pH=4.2～4.5，即是所需配置STZ的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物造模與分組 選取8周齡健康雄性Wisart大鼠，體質(zhì)量200～220g，自然光線，不限制飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)l周后禁食12h，將鏈脲佐菌素用0.1mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.2，4℃)避光條件下配成1%濃度溶液，按50mg/kg劑量左下腹腔內(nèi)單次注射，72h后尾靜脈取血測(cè)血糖，凡血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病大鼠。將50只糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組(A)、彌可保組(B)、黃芪桂枝五物湯低(C)、中(D)、高劑量組(E)5組。5組動(dòng)物的血糖水平在研究基礎(chǔ)上一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。另取10只同批無差異大鼠作為正常對(duì)照組(F)。

1.4.2 給藥方法 模型復(fù)制1周后，加味黃芪桂枝五物湯低、中、高劑量組分別按4.5g/kg、9 g/kg、12.5g/kg劑量灌胃給藥，正常組和模型組灌服等容積的蒸餾水，彌可保組按375ug/kg灌胃，灌胃每日1次，連續(xù)8周給藥后取標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。所需藥液用蒸餾水定期配制，4℃冰箱保存，大鼠實(shí)驗(yàn)期間按組分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料自由攝食、飲水。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.4 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測(cè) 第8周治療結(jié)束后，以戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，在麻醉狀態(tài)下經(jīng)十六導(dǎo)電生理儀檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度(MNCV)［6］。用2個(gè)電極針經(jīng)皮插入，第一刺激部位在坐骨窩，第二刺激部位在踝部，電極間距為2mm，接地于尾部，用方形波(10～20mA，40us脈波寬)刺激坐骨神經(jīng)，用2個(gè)針電極在同側(cè)的足部骨間肌記錄復(fù)合肌肉動(dòng)作電位。記錄3對(duì)不同的M波潛伏期取其平均值，近端和遠(yuǎn)端的潛伏期差值作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)在2個(gè)刺激部位間的傳導(dǎo)時(shí)間，再測(cè)量出2個(gè)刺激部位間的距離。根據(jù)公式計(jì)算MNCV(m/s)=距離/潛伏期差值，同樣方法檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度:(SNCV)=距離/潛伏期差值。

1.4.5 大鼠NGF表達(dá) 上述步驟完成后，大鼠在麻醉狀態(tài)下迅速剝離大腦海馬組織，置于4%的多聚甲醛固定液中固定。常規(guī)石蠟包埋、切片，以75%明膠處理過的載玻片接片，60℃烘片30min備用。所有步驟嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明進(jìn)行操作，圖片分析采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每鼠取切片5張，400倍鏡下檢測(cè)各片的平均光密度值并計(jì)算 density值，分別測(cè)定后累加取其平均值，即為density值。終值單位為像素點(diǎn)，檢測(cè)場(chǎng)面積為15萬個(gè)像素點(diǎn)。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS 17.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠精神狀態(tài)良好，動(dòng)作自如，毛色光澤。其余各組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦，皮毛污穢無光澤，精神萎靡，蜷臥拱背、后肢活動(dòng)不靈活甚至痿廢不用等現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)過程中模型組大鼠于第3周死亡2只，經(jīng)解剖死于巨結(jié)腸，黃芪桂枝五物湯低劑量組1只于實(shí)驗(yàn)第1周死于灌胃不當(dāng)，其余組別大鼠未見死亡。

3.2 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度

表1顯示，模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度表達(dá)明顯低于其他各組，提示周圍神經(jīng)病變明顯，各治療組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或0.001)，提示藥物干預(yù)具有不同提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度作用，其強(qiáng)弱順序?yàn)镕組＞E組＞D組＞C組＞B組。

表1 藥物干預(yù)8周后不同組別坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度

3.3 神經(jīng)生長因子的表達(dá)

表2圖1顯示，模型組大鼠NGF表達(dá)明顯低于其他各組，各治療組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或0.001)，提示藥物干預(yù)具有不同促進(jìn)NGF表達(dá)的作用，其強(qiáng)弱順序?yàn)镕組＞E組＞D組＞C組＞B組。

表2 藥物干預(yù)8周后不同組別神經(jīng)生長因子的表達(dá)

圖1 光鏡下神經(jīng)生長因子比較

4 討論

目前國內(nèi)外廣泛認(rèn)可的使用鏈脈佐菌素(STZ)制備糖尿病動(dòng)物模型(血糖值大于16.65mmo1/L作為糖尿病大鼠空腹或非空腹的成模標(biāo)準(zhǔn))［7］，因其同時(shí)具備了人類糖尿病性周圍神經(jīng)病變的特點(diǎn)［8］，從而被廣泛地應(yīng)用于DPN的實(shí)驗(yàn)研究之中。坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低是糖尿病大鼠模型的周圍神經(jīng)病變特點(diǎn)之一［9］。DPN時(shí)，神經(jīng)功能的改變先于并伴隨神經(jīng)解剖的損害，因而神經(jīng)電生理檢查作為早期診斷DPN的敏感指標(biāo)被大家認(rèn)可;臨床上許多DPN患者在出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、感覺障礙之前就有明顯的神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢［10］現(xiàn)象，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢被看做是糖尿病性神經(jīng)病變發(fā)生的先兆之一，這也是該項(xiàng)檢測(cè)成為目前評(píng)價(jià)糖尿病患者神經(jīng)功能最常用指標(biāo)的原因;神經(jīng)生長因子(NGF)是最先發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，NGF是交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和中樞部分膽堿能神經(jīng)元生長、發(fā)育、存活、維持功能所必需的營養(yǎng)因子，其生物學(xué)活性主要是維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)的功能，能誘導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的合成、蛋白磷酸化、甲基化以及類似ras蛋白的基因表達(dá)所需酶的合成，能有選擇地營養(yǎng)交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的小纖維感覺神經(jīng)元。已有實(shí)驗(yàn)證明，無論是糖尿病動(dòng)物模型還是糖尿病神經(jīng)病變患者，其組織或血中的NGF水平均明顯降低［11-12］。本次實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯降低，神經(jīng)生長因子表達(dá)明顯下調(diào)，與正常對(duì)照組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示模型組大鼠具備DPN的特點(diǎn)。

目前，西醫(yī)針對(duì)DPN缺乏理想的治療方法［13］，中醫(yī)學(xué)從整體出發(fā)，調(diào)理陰陽，對(duì)于該病復(fù)雜病理機(jī)制，中藥復(fù)方的作用呈現(xiàn)出多途徑、多靶點(diǎn)和多系統(tǒng)的特點(diǎn)，尤其是在改善患者癥狀、提高生活質(zhì)量及遠(yuǎn)期療效上顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，是單靶點(diǎn)和單系統(tǒng)化學(xué)合成藥不可比擬的。因此，充分發(fā)揮中醫(yī)藥簡便效廉的特點(diǎn)，開發(fā)有效中藥復(fù)方，對(duì)解決DPN這一臨床難題是切實(shí)可行的。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》:“血痹，陰陽俱微，寸口關(guān)上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風(fēng)痹狀，黃芪桂枝五物湯主之。”方中黃芪為君藥，甘溫益氣固表;桂枝散風(fēng)寒而溫經(jīng)通痹;芍藥養(yǎng)血和營而通血痹，與桂枝合用，調(diào)和營衛(wèi)而和表里，兩藥為臣;生姜辛溫，疏散風(fēng)邪，以助桂枝之力;大棗甘溫，養(yǎng)血益氣以資黃芪、芍藥之功，兩藥為佐使，5味藥物配伍精當(dāng)，共奏養(yǎng)血祛風(fēng)、益氣通絡(luò)、調(diào)和營衛(wèi)之功。臨床之中以身體外周痛、癢、麻木為該方的使用要點(diǎn)，這正與糖尿病周圍神經(jīng)病變的常見表現(xiàn)相類似，都反映了營衛(wèi)氣血不足、風(fēng)寒閉阻經(jīng)絡(luò)這一核心病機(jī)，因此針對(duì)這一核心病機(jī)的黃芪桂枝五物湯可作為臨床治療DPN的基本方。本次實(shí)驗(yàn)觀察到，彌可保組較模型組大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度和NGF表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明彌可保對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠周圍神經(jīng)損害有一定的防治作用，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致［13］。但我們同時(shí)觀察到，黃芪桂枝五物湯高、中、低劑量組亦有效提高糖尿病大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度，并上調(diào)NGF的表達(dá)，與模型組和彌可保組比較，差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01)，顯示黃芪桂枝五物湯對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能有明顯改善作用，其作用與劑量成正比，上調(diào)NGF的表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

［1］Laslie Rd.United Kingdorn Prospective.Diabeters study(UKPDS).WHAT now or so what?［J］.Diabetes Metab Res Rev，2003，15:65.

［2］劉建農(nóng)，鄧蓉燕，彭乃群.加味黃芪桂枝五物湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變38 例［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(9):1755.

［3］舒長興.黃芪桂枝五物湯加減治療糖尿病周圍神經(jīng)病變34例［J］.江西中醫(yī)藥，2007，38(9):24.

［4］憨蘭.黃芪桂枝五物湯加減治療糖尿病周圍神經(jīng)病變24例［J］.甘肅中醫(yī)，2008，21(2):8.

［5］高岑，宋俊生，薛曉煥，等.黃芪桂枝五物湯與西藥治療糖尿病周圍神經(jīng)病變療效比較的系統(tǒng)評(píng)價(jià)［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2012，39(6):993-994.

［6］Kalichm an M W，D ines KC，Bobik M，et al.Nerve conduction velocity，laser Doppler flow，and axonalcaliber in galactose and streptozocin［J］.Brain Res，1998，810(1-2):130-1376.

［7］Hensley K，F(xiàn)olyd RA.Reactive oxygen species and protein oxidation in aging:a look back［J］.Biochem Biophys，2002，397(2):377-383.

［8］Coppey LJ，Davidson EP，Dunlap JA，et al.Yorek MA.Slowing of motor nerve condu-ction velocity in streptozotocin-induced diabetic rats is preceded by impaired vasodilation in arterioles that overlie the sciatic nerve［J］.Int J Exp Diabetes Res，2000，1(2):131-143.

［9］劉立新，劉好文，劉力強(qiáng)，等.實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型及其周圍神經(jīng)病變特點(diǎn)［J］.腦與神經(jīng)疾病雜志，2005，13(2):117-118.

［10］Sekido H，Suzuki T，Jomori，T，et al.Reduced cell replication and induction of apoptosis by advanced glycation end products in rats Schwann cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，320(1):241-248.

［11］Hellweg H，Hariung HD.Endogenous levels of nerve growth factor(NGF)are altered in experimental diabetes mellitus:a possible role for NGF in the Pathogenesis of diabetic neuropathy［J］.Joumal of Neurosciene Research，1990，26:258.

［12］FaradjiV，Sotelo J.Lower serum levels of nerve growth factor in diabetic neuropathy［J］.Acta-Neurol Scand，1990，81:402.

［13］Smith AG，Singleton JR.Diabetic neuropathy［J］.Continuum(Minneapolis Minn)，2012 ，18(1):60-84.

［14］張蜀平，陸菊明，潘長玉，等.彌可保對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變治療作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華內(nèi)分泌雜志，1998，14，(2):130-131.