鄭亞萍，康紅鈺

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南漯河 462002)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是糖尿病致殘致死的重要原因。赤芍組成的方劑具有明顯保腎療效［1］，但單方赤芍對(duì)糖尿病腎病的作用及相關(guān)機(jī)制尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察赤芍對(duì)DN腎功能的影響及腎組織相應(yīng)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)和巨噬細(xì)胞ED-1表達(dá)變化，初步探討赤芍對(duì)DN發(fā)生、發(fā)展的作用以及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

體質(zhì)量200～250g的雌性SD大鼠，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑

鏈脲佐霉素(STZ，Sigma公司產(chǎn)品)，赤芍注射液(漯河醫(yī)專分析測(cè)試中心)，小鼠抗大鼠ED-1(巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志)，單克隆抗體(美國(guó) Santa Cruz公司)，鏈酶親和素-生物素復(fù)合物、DAB試劑盒(武漢博士德)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.3 DN模型和分組

采用左腎摘除加高糖高脂飲食加小劑量STZ 30mg/kg腹腔注射制備糖尿病腎病模型，以注射72h后血糖高于16.7mmol/L，為 DN模型建立成功［2］。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、糖尿病腎病組(DN組)、赤芍組腹腔注射30g/kg赤芍，正常對(duì)照組和糖尿病腎病組給予同劑量的生理鹽水腹腔注射，每日1次，連續(xù)給藥8周。

1.4 標(biāo)本采集及處理

第8周末收集各組大鼠24h尿，離心后－20℃保存;動(dòng)物麻醉稱重，股動(dòng)脈放血，離心后血清－80℃保存;取右腎去包膜后稱重并于4%甲醛固定。

1.5 血尿素氮(BUN)、內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)及24h尿蛋白測(cè)定

用OLYMBUSAU-600全自動(dòng)生化儀測(cè)測(cè)大鼠尿素氮、血肌酐，采用放免法測(cè)定24h尿微量蛋白含量。

1.6 RT-PCR 檢測(cè) TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)

按Trizol說(shuō)明提取細(xì)胞 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，為其以模板做PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片斷引物TNF-α(203bp):5’-TTCTCATCCTGCTCGTGG-3’，5’-TTTGGTGGTTCGCCTCCT-3’;MCP-1(432bp):5’-GCCAGATCTCTCTTCCTCCA-3’;5’-GAGG TG GTTGTGGAAAAGAG-3’;ICAM-1:(413bp)5’-GG CG TCCATTTACACCTATTA-3’，5’-TTCCTTTTCTT CTCTTGCTTG-3’;內(nèi)參基因 β-actin(141bp):5’-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3’，5’-AGAT CCACATCTGCTGGAAGGT-3’。PCR產(chǎn)物在10g/L瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳檢測(cè)，以 Marker為分子大小標(biāo)記，以與內(nèi)參β-actin的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶光密度之比作為反映 TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA水平的相對(duì)指標(biāo)。

1.7 SABC法檢測(cè)腎臟ED-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波封閉內(nèi)源性生物素;滴加1∶10正常羊血清或兔血清;10%小牛血清蛋白封閉非特異性抗原。滴加小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體(1∶50)，4℃過(guò)夜。滴加生物素化二抗IgG(1∶200)，37℃ 20min滴加SABC，37℃ 20min。洗滌后室溫下滴加DAB顯色液，鏡下控制顯色時(shí)間。中止反應(yīng)后，蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸乙醇分化。常規(guī)脫水、透明、封片。實(shí)驗(yàn)采用刪除第一抗體作陰性對(duì)照。陽(yáng)性物質(zhì)呈棕色顆粒狀，高倍鏡視野下隨機(jī)選擇30個(gè)腎小球，計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球橫截面積(gcs)ED-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般指標(biāo)

表1顯示，與對(duì)照組比較，DN組顯著增加BUN、Ccr、24h尿微量蛋白及腎重/體質(zhì)量(P＜ 0.01)，赤芍可顯著抑制糖尿病腎病大鼠的BUN、Scr、24h尿微量蛋白及腎重/體質(zhì)量增加。

表1 各組DN大鼠BUN、Scr、24h尿微量蛋白及腎重/體質(zhì)量(±s)

表1 各組DN大鼠BUN、Scr、24h尿微量蛋白及腎重/體質(zhì)量(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01;與DN組比較:#P ＜ 0.05，##P ＜0.01

組 別 例數(shù)(只)BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)24h尿微量蛋白(μg/24h)腎重/體質(zhì)量/×10－3正常對(duì)照組10 6.49 ±0.68 39.4 ±3.2 14.35 ±2.53 2.9 ±0.6 DN 組 12 17.28 ±1.44＊＊ 58.9 ±6.4＊＊ 43.85 ±9.18＊＊ 6.8 ±0.7＊＊赤 芍 組 10 12.64 ±0.83*## 46.7 ±4.8*# 25.53 ±9.27*## 4.1 ±0.5*#

2.2 各組大鼠腎臟 TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)

表2各組大鼠腎臟TNF-α、MCP-1、ICAM-1mRNA表達(dá)(±s)

表2各組大鼠腎臟TNF-α、MCP-1、ICAM-1mRNA表達(dá)(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01;與 DN組比較:#P ＜0.05，##P ＜ 0.01

組 別 例數(shù)(只) TNF-αMCP-1 ICAM-1正常對(duì)照組10 0.56 ±0.11 0.89 ±0.15 1.08 ±0.16 DN 組 12 2.09 ±0.32＊＊ 1.93 ±0.38＊＊ 2.33 ±0.15＊＊赤 芍 組 10 0.97 ±0.26*##1.25 ±0.19*## 1.35 ±0.13##

表2顯示，與對(duì)照組比較，DN組 TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)顯著增加(均P＜ 0.01)，而赤芍抑制糖尿病腎病大鼠的TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)(圖1～3)。

圖1 各組大鼠腎臟TNF-αmRNA表達(dá)

圖2 各組大鼠腎臟MCP-1mRNA表達(dá)

圖3 各組大鼠腎臟ICAM-1mRNA表達(dá)

2.3 各組大鼠腎臟ED-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

表3顯示，DN組腎小球可見(jiàn)呈現(xiàn)褐色顆粒ED-1陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞顯著較對(duì)照組增多(P＜0.01)(圖4)，赤芍組可減少腎小球內(nèi)褐色顆粒ED-1陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及增殖顯著增加(P＜0.01)。

圖4 各組腎小球ED-1陽(yáng)性表達(dá)(×400)

3 討論

TNF-α是由激活的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的小分子多肽，能發(fā)揮聚集巨噬細(xì)胞、刺激成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，在腎組織纖維化起重要作用。有研究顯示，TNF-α 可通過(guò)上調(diào) MCP-1及 ICAM 表達(dá)［2］，進(jìn)而促使巨噬細(xì)胞遷移至受累組織。本研究顯示，鏈脲佐霉素腹腔注射制備的大鼠DN模型TNF-αmRNA表達(dá)及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、增殖較對(duì)照組顯著增加。

表3各組大鼠腎臟ED-1表達(dá)(±s)

表3各組大鼠腎臟ED-1表達(dá)(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與DN組比較:#P＜ 0.05，##P ＜ 0.01

組別 例數(shù)(只) 腎小球(n·gcs－1)正 常 對(duì) 照 組10 0.91 ±0.53 DN 組 12 3.75 ±1.09＊＊赤 芍 組 10 2.13 ±0.68*##

單核-巨噬細(xì)胞、腎小管細(xì)胞等可產(chǎn)生 MCP-1，MCP-1對(duì)單核巨噬細(xì)胞具有特異性趨化激活作用，且隨后引發(fā)膠原 mRNA表達(dá)增加 ，這與腎小球纖維化密切相關(guān)［3，4］。敲除ICAM-1基因大鼠腎小球巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，Ⅳ膠原增生也下降［2，5］，證實(shí)MCP-1、ICAM-1在糖尿病腎臟病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，鏈脲佐霉素所致的DN腎小球就有ICAM-1及MCP-1 mRNA的表達(dá)增加。

單核-巨噬細(xì)胞在腎小球和腎間質(zhì)浸潤(rùn)是DN的特征性表現(xiàn)，腎組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞在激活后產(chǎn)生損傷介質(zhì)，巨噬細(xì)胞局部增殖與腎臟病理?yè)p害及腎功能衰退密切相關(guān)，對(duì)DN的發(fā)生發(fā)展起重要作用［6，7］。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎小球有大量ED-1表達(dá)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，且其浸潤(rùn)程度顯著高于對(duì)照組大鼠，聚集的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子如TNF-α、ICAM-1及 MCP-1，進(jìn)一步加速了腎組織纖維化。

赤芍能下調(diào)血脂、抑制血小板聚集及血栓形成，臨床研究已有其組方治療糖尿病腎病。我們先前研究表明，其能降低血脂、減少BUN、Scr及24h尿微量蛋白，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討赤芍對(duì)DN保護(hù)作用機(jī)制，結(jié)果顯示赤芍能通過(guò)抑制 TNF-α來(lái)減少腎組織 ICAM-1及MCP-1表達(dá)，進(jìn)而減少腎組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及增殖，發(fā)揮抗纖維化作用從而產(chǎn)生對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

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