陳敏氡　朱海生等

摘 要： 【目的】為了獲得適宜進(jìn)行草莓果實類胡蘿卜素各組分定性定量分析的方法，【方法】以成熟草莓果實為材料，通過對不同提取劑、提取方法的篩選，優(yōu)化草莓果實類胡蘿卜素的提取條件；通過確定色譜條件以及重復(fù)性、精密度、回收率試驗，建立類胡蘿卜素超高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)分析體系。【結(jié)果】以丙酮∶石油醚=1∶2作為提取劑，皂化提取草莓果實中類胡蘿卜素，同時采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，以乙腈∶甲醇=9∶1為流動相，在450 nm下測定是進(jìn)行草莓果實類胡蘿卜素定性定量分析的最佳方法。成熟草莓中能檢測到葉黃素、β-隱黃質(zhì)、β-胡蘿卜素，含量依次為：118.5、12.6、99.8 μg·kg-1；檢測不到番茄紅素；檢測可以在5 min內(nèi)完成，比常規(guī)方法節(jié)約時間70%左右；方法平均回收率達(dá)到93.2%，變異系數(shù)為1.32%～1.86%?！窘Y(jié)論】提取方法和超高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)分析體系適合草莓果實類胡蘿卜素各組分的定性定量分析。

關(guān)鍵詞： 草莓； 類胡蘿卜素； 高效液相色譜法（UPLC）

中圖分類號：S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0706-06

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬薔薇科多年生草本植物，果實鮮美紅嫩，濃郁多汁，果味芳香并且營養(yǎng)豐富，素有“水果皇后”之稱。近年來，隨著草莓經(jīng)濟(jì)價值的日益走俏，人們開始越來越重視草莓的果實品質(zhì)。類胡蘿卜素既是決定水果、蔬菜內(nèi)在營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是影響果實外觀品質(zhì)和花卉觀賞價值的重要因素[1]。越來越多的醫(yī)學(xué)研究表明，除了β-胡蘿卜素是維生素A的前體外，許多類胡蘿卜素在猝滅自由基、增強(qiáng)人體免疫力、預(yù)防心血管疾病和防癌抗癌等保護(hù)人類健康方面起著重要的作用[2-3]。目前草莓類胡蘿卜素種類和含量測定尚未見報道，缺少準(zhǔn)確可靠的檢測方法，因此建立一種快速、準(zhǔn)確的測定方法對合理開發(fā)和利用我國草莓資源具有重要的理論價值和應(yīng)用前景。

檢測植物中類胡蘿卜素的方法有紙層析法、柱層析法、薄層層析法、膜層析法和高效液相色譜法[4]。超高效液相色譜（Ultra performance liquid chromatography， UPLC）是近幾年推出的一種新的液相色譜技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的分析方法帶來的分辨率限制、操作繁雜、無法檢測到更多種類的類胡蘿卜素的缺點，UPLC以更短的填料色譜柱，耐受超高壓（40 Mpa）色譜泵和色譜系統(tǒng)，使分離速度、靈敏度、分離度達(dá)到普通HPLC的9、3、1.7倍，體現(xiàn)出明顯的超高選擇性、超高分離度、超高靈敏度以及超高速等優(yōu)勢，在蛋白組學(xué)、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測等眾多高端領(lǐng)域得到應(yīng)用[5-6]，利用UPLC測定分析類胡蘿卜素僅在番茄制品等食品上有過報道[7]。利用UPLC測定分析類胡蘿卜素在草莓上屬首次。本試驗通過篩選草莓果實類胡蘿卜素的提取條件，來優(yōu)化提取方法；同時利用UPLC對草莓果實類胡蘿卜素各個成分進(jìn)行測定和分析，建立適合草莓果實類胡蘿卜素定性和定量分析的最佳方法，為今后進(jìn)一步研究草莓果實類胡蘿卜素積累規(guī)律提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

草莓品種為‘法蘭地，采后直接置于-70 ℃冷凍保存待測。

1.2 試劑

1.3 儀器

1.4 方法

1.4.1 草莓類胡蘿卜素的提取 1）浸提。將成熟的草莓果肉置于預(yù)冷的研缽中，用液氮快速研磨至粉末狀，準(zhǔn)確稱取5 g，加入20 mL浸提劑于50 ℃，避光浸提3 h，過濾收集浸提液，重復(fù)操作至殘渣發(fā)白，合并浸提液，定容至50 mL，備用。

2）萃取。采用未經(jīng)皂化和皂化2種處理方法萃取果實中類胡蘿卜素，重復(fù)試驗3次，在波長450 nm下，用紫外分光光度計測定吸光度A。

2）確定UPLC色譜條件。篩選適宜流動相及其他色譜條件。

3）重復(fù)性、精密度試驗。取4種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別計算保留時間和峰面積的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，來測定儀器的重復(fù)性以及方法的精密性。

4）回收率試驗。用液氮將草莓果實研磨成粉，平均分成5份，其中4份分別加入20 μg 4種標(biāo)準(zhǔn)品，剩下1份不加入標(biāo)準(zhǔn)品，作為空白對照。按前述的草莓果實類胡蘿卜素提取方法進(jìn)行提取，測定5份樣品的類胡蘿卜素含量，計算類胡蘿卜素的回收率，同樣試驗條件下平行測定3次。

1.4.3 草莓類胡蘿卜素總量及不同組分含量的測定

類胡蘿卜素總量參照《GB/12291-1990水果、蔬菜汁類胡蘿卜素全量的測定方法》[8]，利用紫外分光光度計測定。類胡蘿卜素各組分及其含量利用UPLC標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行檢測，上機(jī)前用流動相進(jìn)行稀釋，經(jīng)0.22 μm微孔過濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓果實類胡蘿卜素最佳提取條件的篩選

2.2 類胡蘿卜素UPLC標(biāo)準(zhǔn)體系的建立

2.3 草莓果實中類胡蘿卜素成分及其含量的測定

3 討 論

類胡蘿卜素的提取溶劑很多，但由于試驗樣品的多樣性以及類胡蘿卜素種類的繁多性，使得沒有一種溶劑能適合所有樣品中類胡蘿卜素的提取[9]。在辣椒中以葉黃素類作為主要提取物時，乙醇是較好的有機(jī)溶劑；在番茄汁中以番茄紅素為主要提取物時，乙醇和正己烷混合是較好的有機(jī)溶劑[10]；在桃中以β-胡蘿卜素為主要提取物時，丙酮是較好的有機(jī)溶劑[11]。因此，為了提高提取效率，應(yīng)該針對草莓篩選出最佳的提取劑。本試驗采用7種有機(jī)溶劑或組合對草莓果實進(jìn)行浸提，結(jié)果表明在草莓果實中以葉黃素和β-胡蘿卜素為主要提取物時，丙酮∶石油醚=1∶2（各自含0.1%BHT）是最佳的提取劑。

蔬菜、 水果中的類胡蘿卜素主要以脂肪酸酯的形式存在， 其酯化程度依葉黃素中羥基數(shù)目的多少而變化[12]。因此，在提取時常常對材料進(jìn)行皂化處理，旨在水解類胡蘿卜素酯，得到游離態(tài)類胡蘿卜素單體，同時除去葉綠素干擾，達(dá)到簡化分離準(zhǔn)確定量的目的[13]。然而皂化的同時會導(dǎo)致類胡蘿卜素總量或單個類胡蘿卜素的降解損失，這種損失取決于皂化的條件和樣品的成分[14-15]。沙棘[16]、柑橘[13]等在類胡蘿卜素提取過程中經(jīng)皂化處理，取得較好效果，而在桃類[11]、蘋果[17]等胡蘿卜素提取過程中，不經(jīng)過皂化處理的方法較合適。本試驗結(jié)果表明皂化處理可以明顯提高草莓果實中類胡蘿卜素的提取效果。

近年來，類胡蘿卜素測定方法主要有分光光度法[18]、薄層色譜法（TLC）[19]、柱層析法[20]、高效液相色譜法（HPLC）[21]等。其中分光光度法常用于測定純類胡蘿卜素的量或濃度，或用來估算混合物或天然萃取物中的總類胡蘿卜素含量，然而這種方法不能排除樣品中其他類胡蘿卜素的干擾，定量不準(zhǔn)確，精確度相對較低[11，22]。薄層色譜法具有操作簡便、快速等特點，比較多的用于定性分析，但也不易定量[11，22]；高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、高靈敏度、分析速度快等優(yōu)點，但分析時間長，有的還無法將某些類胡蘿卜素分開[7]。超高效液相色譜法不僅保有高效液相色譜法的優(yōu)點，而且還很好的克服了分析時間長的弊端，相較于HPLC法檢測類胡蘿卜素要20 min左右，UPLC在5 min內(nèi)就可以完成檢測，節(jié)約時間70%左右。此外，本試驗采用超高效液相色譜法，只以乙腈∶甲醇=9∶1（v/v） 為流動相，無需梯度洗脫同時避免使用二氯甲烷，就將4個標(biāo)準(zhǔn)樣品徹底分離，方法簡便，安全。

利用草莓UPLC類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)分析體系，在草莓果實中檢測到葉黃素、β-胡蘿卜素和β-隱黃質(zhì)，含量依次為118.5、99.8、12.6 μg·kg-1，類胡蘿卜素總含量為428.1 μg·kg-1，沒有檢測到番茄紅素，推測此結(jié)果與品種本身差異有關(guān)。研究表明不同的蔬菜，水果含有的類胡蘿卜素的成分和含量差異較大，且較單一。如萬壽菊、菠菜、羽衣甘藍(lán)主要以葉黃素為主，番茄以番茄紅素為主，而綠葉蔬菜卻以胡蘿卜素為主[23-24]。綜上所述，成熟的草莓果實中含有葉黃素、β-胡蘿卜素和β-隱黃質(zhì)，其中葉黃素含量最高，β-胡蘿卜素次之，β-隱黃質(zhì)含量最少。本試驗建立了草莓類胡蘿卜素超高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)分析體系， 在成熟草莓中檢測到葉黃素、β-隱黃質(zhì)、β-胡蘿卜素，檢測不到番茄紅素，方法簡單快速、重現(xiàn)性好，適合于草莓果實類胡蘿卜素定性定量分析。

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