戴啟東　李廣旭等

摘 要： 【目的】為了明確引起樹莓炭疽病的病原，【方法】從30份標樣中采用組織分離法分離得到了18個代表性菌株，并隨機選取一個菌株LN-14，對該菌株的形態(tài)學特征、菌落特性以及病菌的致病性進行了研究。采用真菌rDNA-ITS區(qū)域通用引物ITS1和ITS4對菌株進行PCR擴增，運用DNAMAN軟件構建該菌株與其他近緣種類菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹?！窘Y果】該菌在PDA培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，產生黑色分生孢子盤，分生孢子無色、單孢子呈橢圓形12～19 μm×4～5 μm 。PCR擴增得到534 bp的特異性片段，測序、比對結果顯示該菌與Colletotrichum gloeosporioides[HQ264183]、C. gloeosporioides[HQ264182]的相似性高達100%，與引起杧果炭疽病的C. gloeosporioides[JX560098]親緣關系較近聚類為同一個分支，而與草莓炭疽病菌C. fragariae[JN943084]親緣關系較遠?！窘Y論】形態(tài)學和分子鑒定表明遼寧地區(qū)樹莓炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

關鍵詞： 樹莓； 炭疽??； 病原鑒定； 膠孢炭疽菌

中圖分類號：S663.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0672-03

樹莓（Rubus idaeus L.）為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）多年生落葉果樹，小灌木。樹莓屬有700余種，主要分布于北半球溫帶、亞熱帶地區(qū)，在我國發(fā)現約200余種[1]。我國目前栽培的品種多由國外引入，隨著樹莓的大量種植，樹莓病蟲害的發(fā)生日趨嚴重。

樹莓炭疽病是樹莓上的一種十分重要的病害。筆者從2010—2012年間，分別在沈陽、丹東、營口、莊河等地的樹莓基地進行了病害取樣調查，發(fā)現在7—9月份該病害普遍發(fā)生，高溫高濕天氣發(fā)生尤為嚴重，該病主要危害葉片，在生長后期也可危害果實，嚴重影響樹莓的產量和品質。到目前為止，引起該病害的病原菌種類尚未見文獻報道。由于炭疽菌屬真菌種類繁多、分布廣泛，形態(tài)差別細微，該屬某些種類在分類學上尚無定論，僅從形態(tài)學特征上很難對該屬真菌進行種間的分類鑒定[2]。我們通過對病原菌的形態(tài)學分析結合rDNA-ITS序列分析的方法對引起樹莓炭疽病的致病菌的進行鑒定，為該病害的進一步系統(tǒng)研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樹莓炭疽病病害標樣的采集

2010年7月中旬至9月末，在遼寧果樹所樹莓苗圃以及沈陽東陵樹莓基地采集樹莓炭疽病發(fā)病葉片標樣30余份，分離得到代表性菌株18份于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌分離及形態(tài)學鑒定

對采集的病葉采用組織分離[3]法進行分離，先用自來水將感病葉片沖洗干凈，然后用蒸餾水沖洗2～3次，在病健交界處切取邊長2 mm的方形組織，放入70%酒精溶液中處理10～20 s，最后用無菌水沖洗3次，然后將病組織在無菌條件下轉移至PDA平板培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，4 d后挑取菌落邊緣新鮮菌絲進行純化，經3次純化后將菌種保存在4 ℃冰箱備用。將保存的菌種25 ℃活化培養(yǎng)，待15～20 d產孢后挑取菌絲及孢子在顯微鏡下觀察照相，參考文獻[4-5]進行病原菌形態(tài)學鑒定。

1.3 樹莓炭疽病菌致病性測定

致病性測定采用針刺法[3]接種。將保存的菌種轉接到PDA平板上，25 ℃活化培養(yǎng)，15～20 d黑光燈照射培養(yǎng)待產孢后，用無菌水洗脫孢子配成濃度為2×105個·mL-1孢子懸浮液，用一次性無菌注射器吸取孢懸液直接穿刺接種分別接種到健康的樹莓葉片上，并做保濕處理，無菌水作為對照，每處理接種8個葉片，3次重復。待發(fā)病后從病斑表面分離病原菌與田間采集的樣品進行比較，并觀察發(fā)病癥狀是否與田間自然發(fā)病癥狀相同。

1.4 rDNA-ITS區(qū)擴增與分析

2 結果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學鑒定

2.2 致病性測定

2.3 樹莓炭疽病菌rDNA-ITS序列分析

3 討 論

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展和成熟，針對rDNA-ITS區(qū)段設計引物并進行PCR檢測的方法被廣泛應用于植物病原菌鑒定、檢測以及病害診斷等方面[7]。由于植物rDNA-ITS區(qū)段在科、屬水平上保守而在種間存在差異，針對這樣的特性設計引物進行PCR檢測已經成為國際上廣泛使用的分子生物學方法[8]。本實驗通過傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定的方法結合rDNA-ITS序列分析的方法鑒定樹莓炭疽病的致病菌種類，明確了該病原菌的分類地位，為該病害的進一步深入研究奠定了基礎。

樹莓炭疽病此前曾有文獻報道是由炭疽菌屬真菌引起的，但沒有具體斷定是炭疽菌屬的哪個種，分類地位尚未明確[9]。本文通過對遼寧地區(qū)采集的樹莓炭疽病菌株鑒定結果認為引起該病的致病菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。由于炭疽屬真菌種類繁多，很多都是重要的植物病原菌，炭疽菌屬的其他種類是否也能引起該病害并導致復合侵染到目前為止尚未見文獻報道，需要今后進一步深入研究。

隨著樹莓的集約化種植，該病害在生長季節(jié)普遍發(fā)生并呈現上升趨勢，尤其在一些感病品種上發(fā)生極為嚴重，引起早期落葉，嚴重影響樹莓的品質、產量和植株壽命。樹莓炭疽病的發(fā)生不同年份區(qū)別很大，冬季受凍害嚴重翌年生長季易于發(fā)病。防治該病害除了施用高效低毒殺菌劑外，加強田間管理也是行之有效的防治手段。注意及時清理田間病殘枝和雜草，清除越冬菌源，合理灌溉和施肥，減少機械損傷，這些措施對病害的防控效果明顯。（本文圖版見插8）

參考文獻 References：

[1] FU Jun-fan. A Color atlas of small furits diseases and pests control[M]. Beijing： China Agriculture Press，2010.

傅俊范. 小漿果病蟲害防治原色圖譜[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社，2010.

[2] ZENG D X. Molecular systematics of the several important species in the genus Colletotrichum （in Chinese）[J]. Acta Phytopathologic Sinica，2002， 32（4）： 372- 373.

[3] FANG Zhong-da. Methods for plant pathoolgy[M]. Beijing： China Agricultural Press，1998.

方中達. 植病研究方法[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社，1998.

[4] LU Jia-yun. Plant pathogenic mycology[M]. Beijing： China Agricultural Press，2001.

陸家云. 植物病原真菌學[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社，2001.

[5] WEI Jing-chao. Identification of fungi[M]. Shanghai： Shanghai Science and Technology Press，1979.

魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海： 上?？茖W技術出版社，1979.

[6] FREDERICK M，AUSUBEL，ROGER BRENT，ROBERT E.KINGSTON. Short protocols in molecular biology[M]. Beijing： Science Press，1998.

[7] ENJALBERT J， DUAN X， LECONTE M. Genetic evidence of local adaptation of wheat yellow rust （ Puccinias stri-iformis f. sp. tritici） within France[J]. Molecular Ecology， 2002， 14： 2065-2073.

[8] PASCUAL C B， TODA T， RAYM ONDO A D. Charac-terization by conventional techniques and PCR of Rhizoctonia solani isolates causing banded leaf sheath blight in maize[J]. Plant Pathology， 2000， 49： 108-118.

[9] FU Jun-fan，FU Chao，YAN Xue-rui，DAI Han-ping，YU Shu-yi，HAN Xiao. Preliminary report of pests and diseases on raspberry in Liaoning province[J]. Journal of Jilin Agricultural University，2009， 31（5）： 661-665.

傅俊范，傅超，嚴雪瑞，代漢萍，于舒怡，韓霄. 遼寧樹莓病蟲害調查初報[J]. 吉林農業(yè)大學學報，2009，31（5）： 661-665.