魏榮興，熊 前，徐 明

(公安部南昌警犬基地，江西 南昌330100)

精子在睪丸內(nèi)形成的過程稱為精子的發(fā)生。精子發(fā)生及調(diào)控一直是生殖生物學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。犬睪丸產(chǎn)生精子的能力受限于遺傳，并受垂體促性腺激素和其他因素的控制和影響，這些因素有些間接通過垂體發(fā)揮作用，有些直接作用于睪丸組織［1］?；虻谋磉_(dá)和調(diào)控對(duì)精子發(fā)生的能力和質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。在人類中，有絲分裂階段的精原細(xì)胞中有405 個(gè)基因表達(dá); 精母細(xì)胞中無DNA 復(fù)制，但許多基因參與這個(gè)過程中的基因重組與DNA 修復(fù)，其中有442個(gè)基因在精母細(xì)胞中高度表達(dá)，在減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞中有175 個(gè)基因表達(dá)［2］。

1 犬精子發(fā)生過程

精子在睪丸的曲細(xì)精管部位生成，其上皮主要由兩種細(xì)胞構(gòu)成，即生精細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)(支持) 細(xì)胞。生精細(xì)胞的依次分裂及分化就是精子發(fā)生過程。犬一般在出生時(shí)曲細(xì)精管還沒有管腔，只有性原細(xì)胞和未分化細(xì)胞，二者在胎兒期就已形成，精子發(fā)生始于性原細(xì)胞變成精原細(xì)胞。由精原細(xì)胞發(fā)生為精子，必須經(jīng)過復(fù)雜的分裂和形成過程，大致可以分為四個(gè)階段。第一階段為A 型精原細(xì)胞分裂為A1 型和A2 型精原細(xì)胞，由A2 型精原細(xì)胞分裂而成中間型精原細(xì)胞，中間型精原細(xì)胞分裂增殖而成的B 型精原細(xì)胞，B 型精原細(xì)胞經(jīng)4 次分裂，先后分裂成為16 個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞，這時(shí)曲細(xì)精管開始出現(xiàn)管腔，此階段需要時(shí)間約為14 d; 第二階段為初級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)行第一次成熟分裂成為2個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，此階段需要時(shí)間約為21 d;第三階段是由次級(jí)精母細(xì)胞再分裂為2 個(gè)精細(xì)胞，并移近至曲細(xì)精管管腔，附著在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞尖端，此階段需要時(shí)間約為0.5 d; 第四階段為精細(xì)胞從營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞獲得發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)形態(tài)改變，細(xì)胞核成為精子頭的主要部分(含遺傳物質(zhì)DNA) ，高爾基體成為頂體，中心小體則變?yōu)榫游驳龋⑦M(jìn)入精細(xì)管腔內(nèi)，這個(gè)過程也稱為精子的形成，需要時(shí)間約為10.5 d［1］。

2 基因調(diào)控

2.1 CAMP 應(yīng)答元件調(diào)節(jié)因子

CREM 是CAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CAMP response eleme binding protein，CREB) 的家族成員，是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，在各種組織中均有表達(dá)，但是在睪丸的濃度比其他任何組織要高100 倍［3］。該家族基因的靶基因調(diào)節(jié)區(qū)域上都含有CREs，如轉(zhuǎn)換蛋白TP1 和TP2、前頂體蛋白(Proacrosin) 和鈣精蛋白(Calspermin) 、精蛋白PN1 和PN2編碼的基因。這些基因的啟動(dòng)子都有CREs。CREs 是由一個(gè)保守的回文系列TGACGTCA構(gòu)成。CREM 通過識(shí)別并結(jié)合到靶基因的CRE 上，對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。CREM 的表達(dá)主要集中在次級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中。該基因?qū)拥某墒焓潜仨毜?，在精子發(fā)生中特別是減數(shù)分裂后階段發(fā)揮至關(guān)重要的作用。精母細(xì)胞完成減數(shù)分裂后，許多生殖細(xì)胞高度特異性的減數(shù)分裂后基因(post meotic gene) 都包含CAMP 應(yīng)答元件，接受CAMP 的調(diào)控［4］。在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，敲除了CREM 的小鼠睪丸內(nèi)，一些非常重要的精子所必須的減數(shù)分裂后基因表達(dá)缺失，如魚精蛋白1 和2 及轉(zhuǎn)型蛋白，從而阻斷了細(xì)胞分化，最終使精細(xì)胞發(fā)生凋亡，精子發(fā)育停留在圓形精子階段，導(dǎo)致小鼠的不孕不育［5］。同時(shí)，CREM 敲除小鼠的睪丸重量比正常小鼠小20% ～25%，精細(xì)胞數(shù)量比正常的少46%［6］。CREM 含有許多功能結(jié)構(gòu)域，包括與DNA 接合及形成二聚體所必需的C端亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域、富含谷氨酰胺的活性結(jié)構(gòu)域，以及側(cè)翼區(qū)域的磷酸受體區(qū)域-P盒［7］。CREM 的轉(zhuǎn)錄還受到促卵泡激素的調(diào)控。Foulkes［8］發(fā)現(xiàn)，沒有分泌FSH 的倉鼠的睪丸內(nèi)也沒有CREM 轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)注射了FSH 后，倉鼠睪丸內(nèi)CREM 的轉(zhuǎn)錄迅速增加。睪丸CREM 的活性依賴與它的激活子蛋白(Activator of CREM in testes，ACT) 。ACT具有活性結(jié)構(gòu)域，能夠激活CREM 的表達(dá)，并且具有表達(dá)組織特異性。Kotaja 等［9］通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小鼠中敲除ACT 雖然可以完成精子分化過程，產(chǎn)生成熟的精子，但是成熟精子的數(shù)量卻非常少，并且有許多形態(tài)異常和無運(yùn)動(dòng)能力的精子，這說明ACT 在精子成型的調(diào)控過程中起了重要作用。

在犬中，CREM 位于2 號(hào)染色體的1755522-1805805 位置。Uyttersprot N 等［10］對(duì)其進(jìn)行了全測(cè)序發(fā)現(xiàn)，犬CREM 編碼的氨基酸序列跟鼠和人的同源氨基酸序列匹配率分別為94.5%和91.0%。他利用三種不同探針的RNA 酶保護(hù)測(cè)定法(RPA) 在多種犬組織中分析了多種CREM 轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)CREM 轉(zhuǎn)錄因子有很強(qiáng)的組織特異表達(dá)，它的活化因子和抑制因子在不同組織的比例也相當(dāng)不同。另外，他通過RT- PCR發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)CREM 異構(gòu)體。然而，目前國(guó)際上還鮮有關(guān)于CREM 在犬精子發(fā)生、發(fā)育中的具體功能性研究。

2.2 TSPY 基因

TSPY(testis-specific protein Y-encoded)基因在睪丸中為特異性表達(dá)，該基因主要表達(dá)于精原細(xì)胞階段，其作用是與精子的分化和增殖有關(guān)［11］。也有報(bào)道稱，TSPY 表達(dá)于精母細(xì)胞階段，其參與了精子變態(tài)，總之TSPY 缺失可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙。

在人類中，TSPY1 基因存在大概21 ～35的拷貝數(shù)變異。該基因的表達(dá)模式和預(yù)測(cè)功能表明，它可能與精子的發(fā)生有關(guān)。為了證明這點(diǎn)，Giachini C 等以意大利中部的154個(gè)不孕不育患者和130 個(gè)正常個(gè)體的精子為樣本，通過q-PCR 實(shí)驗(yàn)得出，TSPY1 與精子發(fā)生的數(shù)量呈極顯著相關(guān)(P ＜0.001) ，并且，低于33 拷貝數(shù)的樣本個(gè)體的精子有不正常參數(shù)的幾率是大于33 拷貝數(shù)樣本個(gè)體的1.5 倍(P ＜0.001) 。這表明TSPY1 與精子發(fā)生效率有很強(qiáng)相關(guān)，并且低拷貝數(shù)的個(gè)體更容易不孕不育［12］。但是Nickkholgh B等，以荷蘭的100 名低生育能力的個(gè)體和100 名正常個(gè)體的精子為樣本，通過q-PCR和Southern blot 印跡雜交的辦法，發(fā)現(xiàn)TSPY的拷貝數(shù)和精子質(zhì)量并沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)［13］。由此可知，TSPY 的拷貝數(shù)對(duì)精子發(fā)生和質(zhì)量的影響是個(gè)非常復(fù)雜的問題，需要進(jìn)一步在功能上進(jìn)行研究和驗(yàn)證才能下結(jié)論。

另外，該基因與生殖細(xì)胞的癌變有很強(qiáng)相關(guān)性，它位于性腺母細(xì)胞瘤的臨界區(qū)域，它在生殖細(xì)胞腫瘤和性腺母細(xì)胞瘤中優(yōu)先表達(dá)，并且它與精原細(xì)胞瘤和前列腺癌的發(fā)生也有很強(qiáng)相關(guān)性［13，14］。

在犬中，在12 號(hào)染色體的71935792 至71953959 區(qū)域發(fā)現(xiàn)了TSPY1 的同源基因，但是對(duì)于其在犬中的功能上的作用和機(jī)制，目前尚未有相關(guān)研究。

2.3 SOX 基因

SOX(SRY-related high mobility group-box gene) 基因是一種重要的早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因，是與位于Y 染色體上的SRY 基因(Sex determing region of Y chromosome) 的正下游，該基因負(fù)責(zé)調(diào)控睪丸的形成。

目前發(fā)現(xiàn)的該基因家族有20 多個(gè)SOX因子中，部分可能跟精子發(fā)生有關(guān)，比如E組的SOX8、SOX9 和SOX10 在支持細(xì)胞中重疊表達(dá)。SOX9 在睪丸生精小管上皮細(xì)胞呈階段特異性表達(dá)。Good fellow 等發(fā)現(xiàn)，SOX9 在雄鼠胚胎的睪丸形成中表達(dá)，而在雌鼠的胚胎中不表達(dá)［15］; 在后續(xù)研究中，Good fellow 等克隆了SOX9 基因，發(fā)現(xiàn)它與SRY 氨基酸的高可變區(qū)盒(High- mobility group box，HMG BOX) 的同源性大于60%，在睪丸的發(fā)育中作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其下游基因的表達(dá)。SRY 基因不是直接調(diào)節(jié)睪丸的發(fā)育而是通過SOX9 共同作用才發(fā)生作用［16］。

SOX 家族廣泛活躍于哺乳動(dòng)物的多種功能調(diào)節(jié)中。犬的SOX9 同源基因位于9 號(hào)染色體的8275049 至8278172 區(qū)域。有報(bào)道稱，SOX9 基因可能跟犬的性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象有關(guān)［17］。關(guān)于其在精子發(fā)生上的作用機(jī)制，還在研究過程中。

2.4 HSF 熱休克因子

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是生物體(或離體培養(yǎng)的細(xì)胞) 在不良環(huán)境因素作用下產(chǎn)生的具有高度保守性的應(yīng)激蛋白，普遍存在于整個(gè)生物界，是一類功能性相關(guān)蛋白質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞受到升高溫度或其他壓力時(shí)它們的表達(dá)就會(huì)增長(zhǎng)［18］，這種表達(dá)的增長(zhǎng)是受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。

在不存在熱休克時(shí)，HSF 也調(diào)控著精子發(fā)生基因的表達(dá)［19］。過表達(dá)HSF1 轉(zhuǎn)基因小鼠的精子發(fā)生阻滯，敲除HSF2 轉(zhuǎn)基因小鼠生育能力低，精子數(shù)量比正常小鼠少70%，睪丸重量減少，精原細(xì)胞大量死亡。表明HSF2 與生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂和存活有關(guān)［20］。

HSF 是犬的一個(gè)非常重要的基因，熱休克反應(yīng)和精子發(fā)生都是犬的非常重要的性狀。這個(gè)基因在動(dòng)物中是個(gè)非常保守的基因。在犬中的同源基因位于1 號(hào)染色體。目前關(guān)于其在犬中的功能上的研究很少，非常值得深入研究。

3 展望

犬的精子發(fā)生是個(gè)非常復(fù)雜而又重要的性狀，其中基因?qū)ζ溆绊懯遣豢珊鲆暤摹Ｉ衔拿枋隽瞬糠直容^重要的基因。目前這些基因在人類、小鼠等其它哺乳動(dòng)物中研究較為深入和廣泛，在犬中，類似的研究卻較為匱乏。雖然，由于哺乳動(dòng)物基因組的相似和同源的特性，犬的精子發(fā)生基因的研究可以從其他哺乳動(dòng)物的研究中得到很好的借鑒和方向，但是相關(guān)基因在犬中具體的功能和作用機(jī)制必須依靠后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和功能驗(yàn)證才能確定。

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