李強 傅繼華

（1 中國藥科大學(xué)2010 級藥理學(xué)碩士研究生 江蘇南京210009；2 中國藥科大學(xué)生理教研室 江蘇南京210009）

非酒精性脂肪肝 (Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是一種無過量飲酒史，但病理學(xué)改變類似酒精性脂肪性肝病，以肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征[1]。近年來隨著人民生活水平的提高，高熱量的飲食習(xí)慣和不良的生活方式使得肥胖、高脂血癥、糖尿病及由此引起的NAFLD 的發(fā)病率有明顯上升的趨勢。雖然脂肪肝被認為是良性病變，但它是許多慢性肝臟疾病的早期階段。

1 NAFLD 的發(fā)病機制

“二次打擊”學(xué)說是Day 等在1998 年提出的[2]，目前已被廣泛接受。一次打擊主要是胰島素抵抗導(dǎo)致肝細胞脂肪變性，形成單純性脂肪肝。二次打擊因素通過增強脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和(或)刺激Kupfer 細胞釋放炎性介質(zhì)，引起脂肪變性的肝細胞發(fā)生氣球樣變和點狀壞死，同時吸引中性粒細胞和淋巴細胞趨化至肝小葉內(nèi)，形成脂肪性肝炎。并在此基礎(chǔ)上促進肝星狀細胞激活、轉(zhuǎn)化和合成細胞外基質(zhì)，從而誘發(fā)進展性肝纖維化。

2 NAFLD 的動物模型研究

目前對脂肪肝的防治研究日益成為醫(yī)學(xué)關(guān)注和研究的焦點，建立不同方法不同因素誘發(fā)的脂肪肝動物模型對脂肪肝的發(fā)病機制研究和藥物治療開發(fā)尤為重要。NAFLD 動物模型采用的實驗動物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家兔、家鴨、小型豬等，但以大鼠造模最為常見。本文重點圍繞大鼠NAFLD模型的研究進展進行綜述。

2.1 營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型 此類模型是通過12周以上的高脂肪、高膽固醇和/或高糖高淀粉飼料喂養(yǎng)誘發(fā)的非酒性脂肪肝模型。成模標準是造模組相對于對照組，血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total Cholesterol, TC)、游離脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA) 和低密度脂蛋白 (Low Density Lipoprotein,LDL)等水平顯著升高；肝臟TC、TG 和FFA 等水平顯著升高；肝細胞明顯水腫，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，呈肝細胞脂肪變性，偶見肝細胞點狀壞死或炎癥等。

2.1.1 高脂飼料誘發(fā)脂肪肝模型 高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 模型在發(fā)病機制上與人類NAFLD 最相似，且多合并肥胖、胰島素抵抗及其他代謝綜合征的組分。高脂飲食構(gòu)造原理基本一致(增加游離脂肪酸的攝取或合成)，主要差別在于飲食中脂肪比例不等(10%～71%)，含或不含高碳水化合物。有研究表明脂肪含量占28%以上的飲食可使動物出現(xiàn)肥胖[3]。在普通飼料中添加豬油或花生油等高脂肪含量物質(zhì)，可促進過氧化反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)生自由基和醛類物質(zhì)，醛類物質(zhì)可與抗氧化劑的活性部位結(jié)合，減少自由基的清除，加速NAFLD 的形成。Aragno 等[4]采用普通飼料添加15%豬油和4%膽固醇飼養(yǎng)大鼠15 周，生化指標顯示模型組大鼠體重、肝指數(shù)、肝臟TG、TC、FFA、LDL 水平均顯著高于對照組，肝臟病理學(xué)切片顯示模型組大鼠肝臟脂肪沉積明顯增加。高思源等[5]采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠并結(jié)合慢性應(yīng)激，12 周后發(fā)現(xiàn)肝臟水溶性總膽固醇、三酰甘油含量明顯升高，肝臟LXRα、PPARγ mRNA 表達進一步下調(diào)，血皮質(zhì)醇濃度升高，用此方法建立NAFLD 模型的過程可能更接近于人類NAFLD 病人的發(fā)病過程。高脂飼料誘發(fā)脂肪肝模型所用飼料的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)與西方人群的飲食結(jié)構(gòu)類似，都是以動物脂肪為主要的能量來源，可以作為模擬西方人群脂肪肝疾病的動物模型。

2.1.2 高碳水化合物誘發(fā)脂肪肝模型 在普通飼料中添加蔗糖或玉米粉等高糖高淀粉含量物質(zhì)，可增加長鏈脂肪酸的合成而使TG 的合成增加，并且當血糖升高時，NADPH 供應(yīng)充分，使乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)變成的膽固醇增加。在Wistar 大鼠的飲用水中加入10%蔗糖，48 h 內(nèi)即能在其體內(nèi)觀察到脂肪酸合成增加。SD 大鼠經(jīng)含糖量極高(蔗糖70%)的飲食喂養(yǎng)后出現(xiàn)肥胖，2～3 周可形成脂肪肝，伴參與脂肪合成的酶類及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成增加[6]。Fu等[7]采用普通飼料添加15%玉米粉和3%膽固醇飼養(yǎng)大鼠12 周，生化指標顯示模型組大鼠肝臟TC、TG 水平，血清TC、TG 和LDL 水平顯著高于對照組。肝臟病理學(xué)切片顯示模型組大鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大泡性和小泡性脂肪變性。該模型所用飼料的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)與東方人群的飲食結(jié)構(gòu)類似，都是以糖類為主要的能量來源，可以作為模擬東方人群脂肪肝疾病的動物模型。

上述兩種模型操作方法簡便，價格低廉，重復(fù)性好，實驗動物死亡率低，對實驗人員無毒，病變過程與人類脂肪肝形成過程類似，病變后逆轉(zhuǎn)緩慢適合藥物干預(yù)治療，是國內(nèi)外常用的脂肪肝模型。但是造模時間長，實驗動物易產(chǎn)生厭食、腹瀉等不良反應(yīng)。

2.1.3 膽堿-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline Deficiency， MCD)飲食脂肪肝模型 MCD 飲食脂肪肝模型是由美國Harlan Teklad 實驗室開創(chuàng)[8]。膽堿又稱為VitB4，是卵磷脂、乙酰膽堿等物質(zhì)的組成成分。當缺少膽堿時，肝臟合成磷脂減少，不能有效地合成脂蛋白, 特別是極低密度脂蛋白(VLDL)；而VLDL 是運輸內(nèi)源性甘油三酯出肝的主要形式，從而使甘油三酯在肝臟內(nèi)積聚，迅速沉積，形成脂肪肝。積累在肝的甘油三酯代謝生成甘油二酯，膽堿與甘油二酯生成卵磷脂減少會導(dǎo)致甘油二酯積累，結(jié)果細胞膜中的卵磷脂會被代謝以提供膽堿，引起肝細胞膜損傷[9]。MCD 飲食喂養(yǎng)的嚙齒類動物，肝組織出現(xiàn)腺泡3 區(qū)嚴重脂肪變，隨后見到以淋巴細胞和多形核白細胞浸潤為主的壞死性炎癥，進一步發(fā)展形成細胞周圍及中央靜脈周圍纖維化[10]。George 等[11]采用MCD 飲食飼養(yǎng)大鼠17 周，肝臟病理學(xué)切片顯示模型組大鼠肝臟2 周后出現(xiàn)輕微脂肪變性，5 周后出現(xiàn)大泡性脂肪變性、炎癥細胞浸潤和肝小葉病變。該模型是經(jīng)典的非酒精性脂肪性肝炎動物模型，操作方法簡便，造模時間短，應(yīng)用極為廣泛。但是MCD 飼料價格昂貴，且人類肝臟不含膽堿氧化酶，不存在膽堿缺乏問題，所以該模型的發(fā)病機制與人類完全不同，它最大的缺點是缺乏人類NAFLD 所具有的胰島素抵抗。目前，該模型主要用于脂肪肝治療藥物的篩選，并可為非肥胖而伴NAFLD 等特殊脂肪營養(yǎng)障礙疾病提供研究思路。2.1.4 全腸外營養(yǎng)(TotalParenteralNutrition,TPN) 脂肪肝模型 TPN 是由賓夕法尼亞大學(xué)的Dudrick 在1968 年首次臨床報道[12]，成年Wistar 大鼠深靜脈插管，電腦輸液泵將營養(yǎng)液以3 mL/h 的速度持續(xù)滴注，當腸外營養(yǎng)液中非蛋白能量達到33%以上或總攝入量占總熱量83%以上時，1 周后大鼠肝臟即出現(xiàn)明顯的脂肪變性，主要是由于甘油三酯積聚所致，此外，尚存在血清VLDL 明顯降低，提示肝臟分泌甘油三脂受抑。Ling 等[13]采用TPN 造模4 d，生化指標顯示模型組大鼠血清C- 反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein，CRP) 和肝臟TG 水平均顯著高于對照組，血清TG 水平顯著低于對照組。該模型造模時間短，形成率高，但是由于操作方法復(fù)雜，限制了該模型的推廣應(yīng)用。

2.2 藥物中毒性脂肪肝模型 藥物或化合物作用引起肝臟脂肪變性，使肝細胞脂質(zhì)成分的合成和(或)攝入增加，或釋放和代謝減低，均能使脂肪在肝細胞內(nèi)堆積，甚至常常為多種機制同時參與、協(xié)同促進脂肪變性的發(fā)生。以下兩種模型操作方法簡便，造模時間短，形成率高，但呈急性病變過程，與人類脂肪肝的發(fā)病機制和病理生理學(xué)改變有著本質(zhì)的區(qū)別，由于藥物具有較大的毒性，實驗動物死亡率高，且對實驗人員有一定的毒性。

2.2.1 四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)脂肪肝模型 CCl4是最早采用的實驗性脂肪肝模型誘導(dǎo)劑。主要機制可能與CCl4誘導(dǎo)CYP2E1 激活及嚴重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成肝細胞結(jié)構(gòu)和功能破壞有關(guān)[14]。Fang 等[15]采用2 mL/kg CCl4灌胃，一周2次，持續(xù)8 周，生化指標顯示模型組大鼠肝臟腫大率達185，TG、MDA 水平顯著高于對照組。

2.2.2 乙硫氨酸脂肪肝模型 灌胃給予雄性Wistar大鼠乙硫氨酸0.25 g/kg，48 h 后血清三酰甘油、總膽固醇、脂蛋白減少，血清酶輕度升高，肝內(nèi)三酰甘油含量明顯升高，病理表現(xiàn)為肝細胞肥大，肝竇消失，肝細胞核旁胞漿空殼，部分形成明顯脂滴，偶見炎性細胞浸潤，無明顯壞死及纖維化[16]。Furuhama等[17]在大鼠飲食中加入0.25%的DL-乙硫氨酸，持續(xù)2 周，生化指標顯示模型組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT) 和總膽固醇含量顯著升高，肝臟病理學(xué)切片顯示模型組大鼠肝臟出現(xiàn)嚴重的脂質(zhì)沉積和纖維化。

2.3 特殊品系脂肪肝模型 特殊品系脂肪肝大鼠是一類由人工選育的，可先天或自發(fā)形成脂肪肝，無需后天給藥或調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)的動物模型。以下兩種模型可用于并發(fā)代謝綜合征的脂肪肝的研究，而不適用于后天營養(yǎng)失調(diào)所致脂肪肝的研究。特殊品系大鼠來源較為稀少，價格昂貴，且死亡率較高，僅適于特定病理機制的研究。

2.3.1 遺傳性肥胖Zucker 大鼠 遺傳性肥胖Zucker 大鼠是一種著名的并得到廣泛應(yīng)用的遺傳性肥胖病模型，可發(fā)生高胰島素血癥、胰島素抵抗而自發(fā)形成糖尿病、肥胖和脂肪肝。Flamment 等[18]證明遺傳性肥胖Zucker 大鼠的體重、肝臟重量、肝臟TG 含量、血糖、胰島素、瘦素、脂聯(lián)素水平均明顯高于普通Zucker 大鼠。

2.3.2 BHE 大鼠 BHE 大鼠是一種生后300 d 自發(fā)形成糖耐量異常，血糖、血脂顯著升高，形成高脂血癥、脂肪肝，但無肥胖的特殊種系[19]。該品系主要用于2 型糖尿病的研究，作為脂肪肝模型應(yīng)用并不廣泛。

3 NAFLD 模型研究展望

一個理想的動物模型符合以下標準：（1）發(fā)病特征與人類脂肪肝病變特征相似；（2）病變有一定發(fā)展過程；（3）形成率高，死亡率低，可控性強，重復(fù)性好；（4）造模方法簡便易行，價格低廉。在上述幾種非酒精性脂肪肝模型中，采用高脂飼料誘導(dǎo)的脂肪肝模型因其操作方法簡便，價格低廉，重復(fù)性好，死亡率低，是國內(nèi)外最常用的造模方法。但是由于人體機體功能的復(fù)雜性和實驗動物種族差異性，以及動物年齡、飼料配方、造模時間以及模型判定指標等方面仍缺乏相對統(tǒng)一標準，使任何一種實驗動物模型都不能全面模擬人類非酒精性脂肪肝的演變過程，無法準確地反映脂肪肝疾病的本質(zhì)，難以滿足所有脂肪肝疾病的科研需要，因此，建立一個能完全反映人類脂肪肝的動物模型比較困難?？傊?，不同造模方法所形成的脂肪肝模型在發(fā)病機制和病理改變等方面具有本質(zhì)的差別，需根據(jù)實驗研究目的的不同，選擇符合人類脂肪肝形成過程及病變特征、造模時間短、動物死亡率低、重復(fù)性好、操作方法較簡便的動物模型進行相關(guān)研究。

[1]敬曉琴.非酒精性脂肪肝的研究進展[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2008,17(6)：509-516

[2]Day CP,James OF.Steatohepatitis：a tale of two “hits”[J]？Gastroenterology,1998,114(4)：842-845

[3]Fan CY,Pan J,Chu R，et al. Hepatocellular and hepatic peroxisomal alterations in mice with a disrupted peroxisomal fatty acyl-coenzyme A oxidase gene[J].The Journal of biological chemistry,1996,271(41)：24 698-2 4710

[4]Aragno M, Tomasinelli CE, Vercellinatto I, et al. SREBP-1c in nonalcoholic fatty liver disease induced by western-type high-fat diet plus fructose in rats[J].Free Radic Biol Med,2009,47(7)：1 067-1 074

[5]高思源,袁曉玲,傅繼華,等.高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合慢性應(yīng)激：一種新穎的大鼠代謝綜合征模型的特點[J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2012,29(8)：501-505

[6]Takahashi Y,Soejima,Fukusato,et al.Animal models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis[J]. World Journal of Gastroenterology,2012,18(19)：2 300

[7]Fu JH,Sun HS,Wang Y,et al.The effects of a fat-and sugar-enriched diet and chronic stress on nonalcoholic fatty liver disease in male wistar rats[J].Dig Dis Sci,2010,55(8)：2 227-2 236

[8]Shinozuka H,Lombardi B. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet[J].Cancer Research,1978,38(4)：1 092-1 098

[9]錢曉武,范竹萍,汪曉紅,等.改良蛋氨酸膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型的建立[J].世界華人消化雜志,2007,15(28)：983-989

[10]劉俊平,范竹萍.從新視角評價非酒精性脂肪性肝炎動物模型[J].胃腸病學(xué),2008,13(8)：502-504

[11]George J, Pera N, Phung N, et al. Lipid peroxidation,stellate cell activation and hepatic fibrogenesis in a rat model of chronic steatohepatitis[J].J Hepatol,2003,39(5)：756-764

[12]Dudrick SJ, Wilmore DW, Vars, et al. Long-term total parenteral nutrition with growth, development, and positive nitrogen balance[J].Surgery,1968,64(1)：134-142

[13]Ling PR,Andersson C,Strijbosch R,et al.Effects of glucose or fat calories in total parenteral nutrition on fat metabolism and systemic inflammation in rats[J].Metabolism,2011,60(2)：195-205

[14]林勝利,卓德祥,王曉紅,等.氧化損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在四氯化碳致大鼠肝脂肪變性中的作用機制[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2006,22(5)：422-430

[15]Fang HL, Lin WC. Corn oil enhancing hepatic lipid peroxidation induced by CCl4does not aggravate liver fibrosis in rats[J].Food Chem Toxicol,2008,46(6)：2 267-2 273

[16]孫蓉,趙志遠,王平,等.脂肝清顆粒對脂肪肝大鼠的影響[J].中藥藥理與臨床,2005,21(3)：56-59

[17]Furuhama K, Yabe K. Application of hepatic tolerance tests to the functional reserve assessment in rat models of fatty liver[J]. J Vet Med Sci,1998,60(5)：635-637

[18]Flamment M, Arvier M, Gallois Y, et al. Fatty liver and insulin resistance in obese Zucker rats： no role for mitochondrial dysfunction[J].Biochimie,2008,90(9)：1 407-1 413

[19]Berdanier CD. The BHE rat： an animal model for the study of non-insulin-dependent diabetes mellitus[J]. FASEB J,1991,5(8)：2 139-2 144