★ 王文 胡鵬翼

（1.江西省皮膚病專(zhuān)科醫(yī)院 南昌 330001；2.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；3.江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

山藥為薯蕷科多年生宿根蔓草植物山藥（拉丁名為Dioscorea opposita Thunb）的塊莖，又名白茹、土薯、大薯、薯藥，具有補(bǔ)脾、益肺、固腎、益精的作用，原名薯蕷，首見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]。山藥主產(chǎn)于河南、廣東、廣西等省亦廣泛栽培，以河南焦作市（古懷慶府）所產(chǎn)“懷山藥”最佳?！侗静菥V目》記載其能“益腎氣，健脾胃，止瀉痢，化痰涏，潤(rùn)皮毛”，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，山藥具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗突變和肝損傷保護(hù)等多種生物活性，主治脾虛泄瀉，久痢，虛勞咳嗽，遺精帶下，小便頻數(shù)，消渴，子宮脫垂。具有益氣補(bǔ)脾、滋補(bǔ)作用、能助消化、補(bǔ)虛勞益氣力，并有緩瀉祛痰等作用。山藥多糖是被公認(rèn)的重要活性成分之一，本文對(duì)山藥飲片中多糖進(jìn)行提取精制，并采用硫酸-苯酚顯色法[2]進(jìn)行含量測(cè)定。山藥中的尿囊素（allantoin）具有生肌作用，被廣泛用于醫(yī)藥、日化、輕工以及生物工程等領(lǐng)域，為山藥主要活性成分之一，與其功效密切相關(guān)，在山藥中含量較高，常作為有效成分評(píng)價(jià)山藥的質(zhì)量，因此本文也對(duì)山藥中尿囊素進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器、試劑、材料

1.1 儀器

ΜV2550紫外分光光度計(jì)（島津）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；BSA223S sartoris分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KDM型控溫電熱套（鄄城華魯電熱儀器有限公司）；KQ-300E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有公司）；XW-80A旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠(chǎng)）；B-490 BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廈門(mén)精藝興業(yè)有限公司）；Megafuge 1.0R離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）

1.2 試劑

硫酸（西隴化工股份有限公司）；苯酚（西隴化工股份有限公司）；無(wú)水乙醇（上海振興化工一廠(chǎng)）；氯仿（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；正丁醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 材料

鐵棍山藥（河南省溫縣康之源懷藥有限公司）；山藥飲片（江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司，批號(hào)1109008，產(chǎn)地河南）；D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，110833-200904）；尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)為11501-200202）。

2 方法與結(jié)果

2.1 山藥多糖的提取[3]

將山藥飲片按重量比為1：9比例加入蒸餾水，熱回流3次，每次2h，合并3次提取液，放冷后過(guò)濾，濾液60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液加入Sevage試劑（V氯仿：V正丁醇=4：1），混合后劇烈振搖20min，然后再4 000r/min離心10min，棄去下層有機(jī)相以及中間層凝聚物，收集上清液，重復(fù)1次。取已脫蛋白的上清液加入95%乙醇至乙醇濃度為80%，可見(jiàn)大量的白色絮狀沉淀析出，4℃冷藏過(guò)夜，收集沉淀，沉淀用丙酮、乙醚、無(wú)水乙醇洗滌多次后，50℃真空干燥即得山藥多糖。

2.2 山藥中尿囊素的提取

精密稱(chēng)取山藥飲片粉末0.25g置25mL容量瓶中，加入20%甲醇溶解稀釋至刻度，超聲0.5h，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾即為山藥飲片供試品溶液。

2.3 山藥多糖的含量測(cè)定

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：取葡萄糖溶液0.4mL，加雙蒸水到2.0mL，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%苯酚溶液1.0mL，用渦旋儀器混勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，再渦旋使之均勻，放置5min后，置沸水浴中加熱15min，取出迅速放在冰水中冷卻至室溫；另以雙蒸水2.0mL，加苯酚和濃硫酸，同上操作做為空白對(duì)照，在300-750nm波長(zhǎng)范圍掃描，結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)為488.7nm，因此選擇489nm作為山藥多糖的含量測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：稱(chēng)取吸取D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品9.99mg置于100mL的容量瓶中，加雙蒸水溶解稀釋到刻度，得到濃度為99.9μg/mL溶液。取99.9μg/mL D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0分置于10mL具塞試管中，各加雙蒸水到2.0mL，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%苯酚溶液1.0mL，用渦旋儀器混勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，再渦旋使之均勻，放置5min后，置沸水浴中加熱15min，取出迅速放在冰水中冷卻至室溫；另以雙蒸水2.0mL，加苯酚和濃硫酸，同上操作做為空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)（489nm）處測(cè)定吸光度值，結(jié)果由吸光度值（A）對(duì)溶液濃度（C）線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=0.0525X+0.0989，r=0.9993，葡萄糖在2.5-12.49μg/mL范圍內(nèi)呈線(xiàn)性。

2.3.3 回收率的測(cè)定 精密量取已知含量的樣品0.5mL，精密加入D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)液（99.9μg/mL）各0.20、0.25、0.3mL，加水至2mL，加6%苯酚1mL，渦旋混勻，迅速加濃硫酸5.0mL，渦旋混勻后放置5min，沸水浴15min，迅速放入冷水中，冷卻至室溫，489nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果實(shí)驗(yàn)測(cè)得平均回收率為98.95%，RSD為3.14%（n=9）。

2.3.4 精密度：取已知含量的樣品溶液連續(xù)測(cè)定5次，按吸光度計(jì)算RSD為0.15%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品按含量測(cè)定方法，每隔20min測(cè)1次，在2h內(nèi)溶液穩(wěn)定，RSD為0.55%。

2.3.6 山藥多糖含量測(cè)定：精確稱(chēng)取山藥多糖10mg，置100mL容量瓶中，蒸餾水超聲溶解稀釋至刻度，取2mL于具塞刻度試管中，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%苯酚溶液1.0mL，用渦旋儀器混勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，再渦旋使之均勻，放置5min后，置沸水浴中加熱15min，取出迅速放在冰水中冷卻至室溫；另以雙蒸水2.0mL，加苯酚和濃硫酸，同上操作做為空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)（489nm）處測(cè)定吸光度值，計(jì)算含量，結(jié)果山藥多糖含量為0.61%，RSD為1.05%。

2.4 山藥尿囊素的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件[4]：phenomenex Luna C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10min，A為5% ～10%）；流速0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為224nm；柱溫為30℃，進(jìn)樣量20μL。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：精密稱(chēng)取尿囊素對(duì)照品5.10mg置25mL容量瓶中，加90%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，濃度為204g/mL，依次量取該溶液0.25、1、2、3、4mL至5mL容量瓶中，90%甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取20μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，并以濃度（C）對(duì)峰面積（A）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程A=11.266C-7.7057，r=0.9991，可見(jiàn)尿囊素在10.2-163.2g/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4.3 回收率：精密稱(chēng)取尿囊素對(duì)照適量，加到已知含量樣品中，按供試品溶液制備方法制備待測(cè)液。精密吸取20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中的尿囊素的含量，結(jié)果回收率的平均值為100.02%，RSD為3.28%（n=6）。

2.4.4 精密度試驗(yàn)：取已知含量的樣品溶液連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=1.12%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：在4h內(nèi)考擦樣品穩(wěn)定性。精密稱(chēng)取山藥飲片，按供試品制備方法制備待測(cè)溶液，精密吸取20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。結(jié)果RSD=1.28%，表明溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 樣品含量測(cè)定：按“2.2”項(xiàng)制備樣品溶液，精密吸取供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，代入線(xiàn)性方程計(jì)算樣品中的尿囊素的含量，結(jié)果含量為0.58%，RSD為0.89%。

3 討論

紫外-可見(jiàn)分光光度法是目前測(cè)定多糖含量最常用的方法，常用的顯色劑有苯酚，蒽酮-硫酸和3，5-二硝基水楊酸（DNS）。前兩者主要利用多糖在強(qiáng)酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，然后與酚類(lèi)或者胺類(lèi)反應(yīng)縮合，生成有特定吸收波長(zhǎng)的有色物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定；DNS法則是利用了多糖的還原性。目前最常用的為苯酚硫酸法，本文建立的硫酸-苯酚法測(cè)定山藥多糖含量，具有精密度良好，重現(xiàn)性強(qiáng)、方便快捷的特點(diǎn)，多糖在2.5-12.49μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回收率高，能準(zhǔn)確快速地進(jìn)行含量測(cè)定。

本文根據(jù)文獻(xiàn)，在經(jīng)典苯酚硫酸法基礎(chǔ)上，采用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液熱提以除去單糖、低聚糖、甙類(lèi)及生物堿等干擾成分，Sevage法脫蛋白，獲得比較純凈的山藥多糖，測(cè)得飲片中多糖含量為0.61%，提取后的山藥水溶性多糖的進(jìn)一步純化和生物活性功能尚待進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，對(duì)山藥藥材尿囊素含量測(cè)定方法研究報(bào)道較多，其中HPLC法為測(cè)定山藥尿囊素含量常用的分析方法，本文建立的HPLC方法，測(cè)定山藥中尿囊素的含量，該法精密度高、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，為山藥的全面質(zhì)量控制提供了參考。

[1]張紅英，趙現(xiàn)敏，崔保安.山藥多糖研究進(jìn)展[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2006，21（127）：87.

[2]徐光域，顏軍，郭曉強(qiáng)，等.硫酸-苯酚定糖法的改進(jìn)與初步應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2005（8）：342-345.

[3]孫鋒，谷文英，丁霄霖.山藥粗多糖的提取工藝[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（3）：79-83.

[4]黃玉仙，易駿，昊巖斌，等.不同山藥種質(zhì)資源的尿囊素含量比較研究[J].福建中醫(yī)藥，2011，42（2）：50-52.