宋天一，李菁華，張 哲，史紅艷，孫延波

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021）

＊ 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)七年制2006級(jí)

蜱傳森林腦炎病毒（Tick－borne encephalitis virus，TBEV）是黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）成員，TBEV引起的腦炎又稱(chēng)森林腦炎，主要流行于歐洲和亞洲［1］，在我國(guó)主要分布于東北地區(qū)，在云南、新疆和西藏也有自然疫源地存在的報(bào)道［2］。人感染TBEV后可引起發(fā)熱、頭痛、意識(shí)障礙、肌肉癱瘓，可發(fā)展為致死性腦炎，病死率為5%～20%［3］。TBEV基因組為長(zhǎng)約11000bp的單股正鏈RNA，由單一閱讀框架編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、M和E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。其中，NS1為相對(duì)分子質(zhì)量約40000的糖蛋白，由包膜蛋白C末端的信號(hào)肽引導(dǎo)分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，NS1在病毒復(fù)制時(shí)不可缺少，因?yàn)镹S1參與病毒外源和內(nèi)源性雙鏈 RNA（dsRNA）的形成［4－5］。此外，病毒感染的患者血清中亦存在NS1蛋白，NS1蛋白可作為血清學(xué)診斷的標(biāo)志。目前已知西尼羅病毒（黃病毒成員）等的NS1蛋白是1種免疫調(diào)節(jié)因子，與互補(bǔ)調(diào)節(jié)因子H結(jié)合后，可以抑制Toll樣受體3（TLR3）信號(hào)通路［6］。本實(shí)驗(yàn)采用基因重組技術(shù)構(gòu)建含TBEV NS1的原核表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步探討TBEV的NS1在TLR3信號(hào)通路及免疫調(diào)節(jié)中的作用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 載體和感受態(tài)細(xì)胞 TBEV NS1基因由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成，以pMD19－T－NS1重組質(zhì)粒保存于DH5α工程菌內(nèi)。pEASY TM－E1表達(dá)載體、T7Promoter Primer、T7Terminator Primer和BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司。

1.2 主要試劑和儀器 限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶kit購(gòu)自Takara公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit購(gòu)自 Tiangen公司；異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和Ampcillin購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；NI－NTA resin、鼠抗HIS標(biāo)簽抗體和堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自北京全式金公司。HZQ－X100振蕩培養(yǎng)箱和高速臺(tái)式離心機(jī)（RJ－TGL－16G）購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；分光光度計(jì)（2800UV／VIS UNIK）購(gòu)自美國(guó)GE公司；數(shù)碼凝膠圖像系統(tǒng)（GIS－2008）購(gòu)自美國(guó)Biometra公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的TBEV NS1基因序列（AY182009）設(shè)計(jì)引物，引物由華大基因公司合成。為構(gòu)建表達(dá)載體，在上、下引物的5′端分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。NS12329：5′－TGCGAATTCGATGTTGGCTGTGCTGTGGA－3′；NS13384：5′－GAACTCGAGTGCCACTACCATTGAGCGAACA－3′（下劃線處為酶切位點(diǎn)）。

1.4 目的基因的擴(kuò)增 利用合成的引物，以質(zhì)粒pMD19－T－NS1為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因NS1，擴(kuò)增條件為94℃、3min，94℃、30s，68℃、30s，72℃、60s，30個(gè)循環(huán)后 ，72℃延伸10min。

1.5 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pEASYTM－E1－NS1的構(gòu)建 將NS1的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pEASY TME1相連（目的片段與質(zhì)粒載體的比例為7∶1），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑取單克隆DH5α于10μL無(wú)菌水，取1μL混合于25μL PCR體系中。采用T7Promoter Primer和目的基因反向引物或用目的基因正向引物和T7Terminator Primer鑒定正確表達(dá)方向的陽(yáng)性重組質(zhì)粒。提取連接正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒并進(jìn)行EcoRⅠ 和XhoⅠ 雙酶切鑒定，利用T7Promoter Prime和T7Terminator Primer測(cè)序。

1.6 重組蛋白His－NS1的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pEASY TM－E1－NS1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.5mmol·L－1于IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)后，取菌液離心收集菌體沉淀，進(jìn)行10%SDS－PAGE分析，確定目的蛋白的表達(dá)。取上清液500mL行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后，4℃、5000r·min－1離心10min，將沉淀重懸后超聲破碎，4℃、12000r·min－1離心30min，取適量上清和沉淀進(jìn)行10%SDS－PAGE分析。超聲破碎細(xì)菌后將包涵體經(jīng)1%Triton X－100洗2次，以10mL（8mol·L－1）尿素重懸，室溫過(guò)夜。用0.45μm濾器過(guò)濾除去雜質(zhì)。采用Ni－NTA樹(shù)脂層析柱純化蛋白，將蛋白樣品上樣于Ni柱，流速60滴·min－1，回收流出液，用5倍體積包涵體溶解液洗柱，3倍體積的20mmol·L－1咪唑洗脫雜蛋白，最后用3倍體積的500mmol·L－1咪唑洗脫目的蛋白。

1.7 重組蛋白His－NS1的 Western blotting分析將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上、封閉，用鼠抗His標(biāo)簽抗體作為一抗，AP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗，BCIP／NBT顯色。將經(jīng)純化后的蛋白稀釋1倍，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，得出待測(cè)蛋白的濃度。用超濾管（相對(duì)分子質(zhì)量為10000以下的蛋白被濾除）濃縮蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增 根據(jù)TBEV NS1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得1條長(zhǎng)度約為1056bp的基因片段，與預(yù)期片段大小一致。見(jiàn)圖1。

圖1 TBEV NS1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of TBEV NS1gene

2.2 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pEASYTM－E1－NS1的鑒定 由于表達(dá)載體pEASYTM－E1由pET載體改造而成，克隆的PCR產(chǎn)物有正向和反向2種。T7 Promoter Primer和目的基因反向引物通過(guò)PCR技術(shù)得到長(zhǎng)度約為1200bp的基因片段（圖2），該片段包括T7Promoter Primer至目的基因起始端的142bp和1056bp的目的基因。說(shuō)明克隆的目的基因?yàn)檎蜻B接。提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒用EcoRⅠ及XhoⅠ 雙酶切得到長(zhǎng)度為5715bp的載體條帶和長(zhǎng)度為1056bp的目的條帶（圖3），進(jìn)一步明確目的基因片段成功克隆至pEASYTM－E1表達(dá)載體。利用BLAST軟件分析重組質(zhì)粒的序列并與GenBank中相應(yīng)的核苷酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示其同源性為100%。

2.3 重組蛋白His－NS1的表達(dá)和純化 含重組質(zhì)粒的細(xì)菌（pEASY TM－E1－NS1）經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，將細(xì)菌離心、煮沸，進(jìn)行SDS－PAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量約40000處出現(xiàn)特征性表達(dá)帶，而未誘導(dǎo)菌未見(jiàn)該特征性表達(dá)帶（圖4）。為進(jìn)一步鑒定重組蛋白His－NS1的表達(dá)形式，通過(guò)超聲破碎裂解含重組質(zhì)粒的細(xì)菌，對(duì)上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE，電泳結(jié)果顯示重組蛋白 His－NS1主要以包涵體形式存在于細(xì)菌中，而細(xì)菌培養(yǎng)物的上清中則無(wú)重組蛋白His－NS1（圖5）。將超聲破碎裂解后所得菌體沉淀 （包括包涵體）用含8mol·L－1尿素的裂解液溶解后，利用鎳離子親和層析柱純化，再利用咪唑洗脫特異結(jié)合的蛋白，經(jīng)10%SDS－PAGE分析表明，純化的表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量約40000處顯示出1條雜交蛋白帶（圖6）。將經(jīng)純化的蛋白稀釋1倍，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得待測(cè)蛋白平均吸光度（A）值為0.140，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)蛋白的濃度約為220mg·L－1。采用超濾管為濃縮蛋白，經(jīng)PBS重懸，最終獲得濃度為5g·L－1的重組蛋白溶液。

圖2 重組質(zhì)粒pEASYTM－E1－NS1的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pEASYTME1－NS1

圖3 重組質(zhì)粒pEASYTM－E1－NS1的雙酶切分析Fig.3 Analysis of recombinant plasmid pEASYTM－E1－NS1 digested by restrictive endonuclease

2.4 重組蛋白His－NS1的 Western blotting分析SDS－PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉，以鼠抗His標(biāo)簽抗體作為一抗，AP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行Western blotting分析，在相對(duì)分子質(zhì)量約40000處可見(jiàn)1條蛋白雜交帶，表明重組蛋白His－NS1能與特異的抗體反應(yīng)（圖7）。

圖4 超聲裂解前細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis of fungus expression product before ultrasound cracking

圖5 超聲裂解后細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig.5 SDS－PAGE analysis of fungus expression product after ultrasound cracking

圖6 重組蛋白His－NS1的純化Fig.6 Purification of recombinant protein His－NS1

圖7 重組蛋白His－NS1的Western blotting分析Fig.7 Western blotting analysis of recombinant protein His－NS1

3 討 論

TBEV所引起的腦炎一般呈現(xiàn)2個(gè)感染階段［7］，在感染早期患者有發(fā)熱、四肢無(wú)力、肌肉疼痛和伴有皮疹，隨著病情的發(fā)展出現(xiàn)高熱、頭痛、惡心嘔吐和腦炎或腦膜炎的臨床表現(xiàn)，兒童患病的死亡率較高。TBEV和黃病毒的其他成員一樣，借助包膜E蛋白感染靶細(xì)胞受體，病毒穿入細(xì)胞內(nèi)釋放病毒基因組，病毒開(kāi)始大量復(fù)制并在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中成熟，最后從細(xì)胞內(nèi)釋放并影響和破壞細(xì)胞的功能［8］。雖然TBEV感染機(jī)體后可誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，但病毒和抗體結(jié)合后通過(guò)免疫球蛋白Fc段受體被巨噬細(xì)胞吞噬非但不能滅活病毒，且可使病毒在巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存在。另一方面，RNA病毒的多聚酶不具有自我修正功能，往往導(dǎo)致病毒E蛋白抗原的變異［9］，是病毒形成免疫逃逸的機(jī)制之一?，F(xiàn)已明確，西尼羅病毒（黃病毒成員）的NS1蛋白能抑制干擾素基因的轉(zhuǎn)錄［10］，其機(jī)制是通過(guò)TLR3信號(hào)途徑阻斷β－干擾素的轉(zhuǎn)錄活化以及通過(guò)IRF3或NF－κB抑制IL－6的轉(zhuǎn)錄。登革病毒（黃病毒成員）的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS4B）可以通過(guò)JAK／STAT信號(hào)途徑［11－12］抑制干擾素的合成。而TBEV NS1在TLR3信號(hào)通路和干擾素合成抑制方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用基因工程方法構(gòu)建了NS1基因表達(dá)載體pEASYTM－E1－NS1，為研究TBEV NS1的多樣生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

pEASY TM－E1表達(dá)載體是由pET載體改造而成，可以在很短的時(shí)間內(nèi)利用TA克隆技術(shù)克隆PCR產(chǎn)物，無(wú)需中間TA克隆技術(shù)環(huán)節(jié)，因此TBEV NS1的PCR產(chǎn)物直接連接至pEASY TME1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)胞后可進(jìn)行目的基因表達(dá)。為確認(rèn)正確表達(dá)方向的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，利用T7Promoter Primer和目的基因反向引物通過(guò)PCR方法，同時(shí)采用限制性酶切分析陽(yáng)性重組質(zhì)粒，確定PCR產(chǎn)物的連接為正向連接。本文作者將含有TBEV NS1的表達(dá)載體（pEASY TM－E1）轉(zhuǎn)染至大腸桿菌進(jìn)行目的基因的表達(dá)。盡管基因工程表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)從大腸桿菌擴(kuò)展至真核細(xì)胞（如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞），但是大腸桿菌仍然是基因表達(dá)的有效工具。本研究旨在獲得目的蛋白在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)，而目的蛋白的表達(dá)受多種因素（誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑的濃度和溫度等）的影響，本文作者最終確認(rèn)最佳的表達(dá)條件是：IPTG濃度為0.5mmol·L－1，37℃誘導(dǎo)4h。經(jīng)超聲處理后，細(xì)菌包涵體通過(guò)變性，上清經(jīng)鎳離子親和層析柱純化再利用咪唑洗脫特異結(jié)合的蛋白，最后采用超濾管（相對(duì)分子質(zhì)量10000以下的蛋白被濾除）濃縮蛋白，經(jīng)PBS重懸，最終獲得濃度為5g·L－1的重組蛋白溶液。高濃度TBEV NS1的獲得，為進(jìn)一步研究其多樣的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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