姜雪鷗，楊 鷹，萬 潔，韋雷飛，鐘金城，李 娜

（1.西南民族大學(xué)動物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，成都 610041；2.攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院，四川 攀枝花 617061）

黑山羊主要分布在海拔2 500米以下地區(qū)，這里年平均氣溫約為15.2℃，年平均相對濕度為69%～70%，黑山羊體格中等，體軀勻稱，略呈長方形。頭呈三角形，鼻梁平直，兩耳向前傾立，公、母羊絕大多數(shù)有角、有髯，公羊角粗大，呈鐮刀狀，略向后外側(cè)扭轉(zhuǎn)，母羊角較小，多向后上方彎曲，向外側(cè)扭轉(zhuǎn)。毛被光澤好，全為黑色。毛被內(nèi)層生長有短而稀的絨毛。隨著外來品種不斷引進以及雜交改良、人工授精和胚胎移植等工作展開，地方品種群體數(shù)量急劇下降，遺傳多樣性降低。

線粒體 DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是唯一核外遺傳物質(zhì)，由于線粒體高拷貝數(shù)、缺乏重組以及單親及母系遺傳等特點而使其成為系統(tǒng)發(fā)育和遺傳結(jié)構(gòu)研究良好素材。而其中片段長為1 220 bp mtDNA D-環(huán)控制區(qū)（D-Loop）是mtDNA基因組中進化速率最高、最具多態(tài)區(qū)域，尤其在高變區(qū)，由于D環(huán)受自然選擇影響較大，存在巨大變異，所以一般用于種群間系統(tǒng)進化分析[1]。

本研究選擇攀枝花各區(qū)縣本地黑山羊，建昌黑山羊，以及周邊黑山羊品種（群體）為研究對象，來分析黑山羊在種內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)，探討攀西黑山羊起源、系統(tǒng)進化關(guān)系及其分類地位。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及基因組DNA提取

隨機選取健康成年黑山羊共185個血樣，黑山羊品種及數(shù)量見表1。使用全基因組DNA提取試劑盒（天根生物公司），提取基因組DNA。

表1 樣本信息Table 1 Information of samples

1.2 PCR擴增、克隆及測序

參照NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov上已有成都麻羊（GenBank Accession No:AF533441）、綿羊（GenBank Accession No:AF039578）、豬（GenBank Accession No:DQ534707）和牦牛（GenBank Acces?sion No:NC_006380）mtDNA D-loop區(qū)序列，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAMAN設(shè)計引物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。引物序列為：PF：5'CATCATTCTAGTAATAATA CC 3'與PR：5'CTTAC?CATGTAAAAGACCCAG 3'。

PCR擴增體系：總體系為25 μL，包括10×Ex Taq Buffer（Mg2+Free）2.5 μL， MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，dNTPMix-ture（各 2.5 mmol·L-1）2 μL，模板DNA（50 ng·μL-1）2 μL，上、下游引物各1 μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.15 μL，滅菌去離子水14.85 μL。

PCR擴增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，62.5℃退火30s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；最后72℃總延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，GV染色并用凝膠成像系統(tǒng)檢測。

根據(jù)檢測結(jié)果，對185只黑山羊mtDNA DLoop區(qū)PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒（Axygene生物公司）進行膠回收分離純化，純化后目片段與pMDTM19-T Vector于16℃恒溫金屬浴中接4 h；而后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中培養(yǎng)；再將菌液涂布在含有X-Gal底物、IPTG誘導(dǎo)物和氨芐青霉素（Ampr）固體LB平板上，利用藍白斑遺傳學(xué)篩選法篩選；用滅菌牙簽挑取白色單一菌落，在含氨卞青霉素（Ampr）LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，將構(gòu)建重組質(zhì)粒通過PCR法轉(zhuǎn)化子鑒定，以確?？寺〕晒ΑＬ崛￡栃灾亟M 質(zhì)粒，將其送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序[2]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果用DNAMAN、BioEdit、DnaSPv5等生物軟件進行序列比對分析；用MEGA生物軟件構(gòu)建不同物種間系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA D-loop擴增結(jié)果

根據(jù)GenBank中綿羊和成都麻羊等序列設(shè)計引物，PCR擴增出黑山羊mtDNA D-loop區(qū)片段長度應(yīng)為1 412 bp，結(jié)果見圖1。

圖1 黑山羊mtDNA D-loop區(qū)全序列PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of the mtDNA D-loop region of Black goat

其中，M泳道為MarkerD2 000，1～9泳道分別為本地黑山羊（YB、LT、ZB、MY）和周邊黑山羊（YL、HL、JC、JT、LZ）PCR產(chǎn)物，本地黑山羊與周邊黑山羊mtDNA D-loop區(qū)PCR擴增產(chǎn)物大小均在1 412 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 mtDNA D-loop區(qū)全序列長度與堿基組成

本研究測定黑山羊9個黑山羊類群185個個體mtDNA D-loop區(qū)全序列，其長度為1 214～1 224 bp，T、C、A、G 4種核苷酸平均比例分別為28.7%（28.5%～28.89%）、25.9%（25.8%～26.2%）、31.1%（31.0%～31.4%）、14.2%（13.7%～14.5%）。

2.3 mtDNA D-loop區(qū)全序列遺傳多樣性分析

通過DnaSPv5軟件分析185頭黑山羊，共檢測mtDNA D-loop區(qū)序列有53種單倍體（見表3），其中HL黑山羊單倍型高于其他8個類群，而MY、YB、ZB黑山羊單倍型數(shù)最小，均為3。Tajima's D檢驗是中性檢驗一種，LT、LZ、JT、ZBTajima's D統(tǒng)計值為正值或者接近零（P＞0.05），說明其Taji?ma's D中性檢驗不顯著，序列進化方式為平衡選擇，且有一些單倍型分化；而其他7個類群Taji?ma's D統(tǒng)計值均為負值（0.01＜P＜0.05），則說明基Tajima's D中性檢驗顯著，進化方式不平衡，為負向選擇，可能由于近一段時期群體擴張產(chǎn)生豐富稀有等位基因[3]。

9個類群mtDNA D-loop區(qū)序列多態(tài)性結(jié)果見表4。

表2 9個類群黑山羊mtDNA D-loop區(qū)堿基組成比較Table 2 Base composition of of the mtDNA D-loop region of Black goat

表3 9個類群黑山羊mtDNA D-loop區(qū)序列單倍型多態(tài)性與核苷酸多樣性Table 3 Nucleotide diversity and haplotype diversity of the mtDNA D-loop region of Black goat

表4 9個類群黑山羊mtDNA D-loop區(qū)序列多態(tài)性Table 4 Polymorphism of the mtDNA D-loop region of Black goat

從表4可知，從群體內(nèi)分析，LZ、JT、HL、YB、ZB各群體多樣性較MY、LT、YL、JC各群體多樣性豐富；LZ群體內(nèi)多態(tài)位點最為豐富（117），而MY群體內(nèi)多態(tài)位點最為貧乏（7）；LZ群體內(nèi)簡約信息位點最多為65個，其次是JT、HL、LZ、YL、ZB、JC、YB，而MY群體內(nèi)簡約信息位點最少為1個。從群體間分析，所有類群共有178個多態(tài)位點，47個單一多態(tài)位點，131個簡約信息位點。核苷酸歧義度是反映群體內(nèi)mtDNA多態(tài)度一個指標(biāo)[4-5]，在所研究各黑山羊群體中，均出現(xiàn)不同程度變異，群體內(nèi)mtDNA多態(tài)程度高低依次為LZ、JT、HL、YB、ZB、JC、YL、LT、MY。9個類群核苷酸歧義度為0.035 00。

2.4 遺傳距離

根據(jù)Mega 5軟件取得九個群體mtDNA D-loop一致序，并與自GenBank中獲取羊族5屬mtDNA D-loop區(qū)序列（各物種名稱、登錄號及序列長度見表5），計算遺傳距離（D），見表6。

表5 其他物種信息Table 5 Information of other species

從表6可知，各類群之間序列差異在0.000～0.188。其中云嶺黑山羊（YL）與大龍?zhí)多l(xiāng)黑山羊（LT）序列差異最小，為0.000，表明親緣關(guān)系最近；其次是攀枝花市建昌黑山羊（JC）分別與云嶺黑山羊（YL）、會理黑山羊（HL）、大龍?zhí)多l(xiāng)黑山羊（LT）序列差異都為0.002；而蠻羊Ammotragus ler?via與綿羊Ovis aries序列差異最大，為0.188，說明親緣關(guān)系最遠。表6也表明，相對于與綿羊Ovis ar?ies、野山 羊 Capra aegagrus、蠻羊 Ammotragus ler?via、塔爾羊Hemitragus jemlahicus和倭巖羊Pseudo?is schaeferi羊族五屬關(guān)系，9個黑山羊群體之間遺傳距離更近，同源性更高。

2.5 聚類結(jié)果

分別用鄰接法和最小進化法構(gòu)建9個群體黑山羊與綿羊Ovis aries、野山羊Capra aegagrus、蠻羊Ammotragus lervia、塔爾羊Hemitragus jemlahicus和倭巖羊Pseudois schaeferi羊族五屬mtDNA D-loop區(qū)序列系統(tǒng)進化樹，如圖2～3所示，兩種方法得出大致相同拓撲結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：會理黑山羊（HL）與攀枝花市建昌黑山羊（JC）屬于同一個類、大龍?zhí)多l(xiāng)黑山羊（LT）與云嶺黑山羊（YL）屬于同一類，兩個分支先與YB聚在一起為一個分支；此分支和ZB為一合枝；以上聚合枝與野山羊Capra aegagrus聚為一個合枝；JT與LZ聚在一起，與上一合枝聚為1類；1類與MY聚為一大類；依次再與塔爾羊Hemitragus jemlahicus、蠻羊 Ammotragus lervia、倭巖羊Pseudois schaeferi、綿羊Ovis aries聚在一起。9個群體黑山羊是同一屬，因而親緣關(guān)系比較近。枝上數(shù)值為重復(fù)1000次支持率。以上系統(tǒng)進化關(guān)系還可以從9個群體黑山羊與羊族五屬遺傳距離得以驗證（見表4）。由圖2還可知，9個類群黑山羊明顯分為3支系，即支系A(chǔ)～C，支系A(chǔ)包括單倍型數(shù)目最多，其次是支系B，支系C只包括1中單倍型。

表6 14個類群mtDNA D-loop區(qū)間遺傳距離（D）Table 6 Genetic distance among 14 groups of Caprini

圖2 用NJ法構(gòu)建mtDNA D-loop區(qū)序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree between 14 groups of Caprini

圖3 用ME法構(gòu)建mtDNA D-loop區(qū)序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 ME phylogenetic tree between 14 groups of Caprini

3 討論與結(jié)論

本試驗根據(jù)NCBI上已有成都麻羊（GenBank Accession No:AF533441）、綿羊（GenBank Acces?sion No:AF039578）、豬（GenBank Accession No:DQ534707）和牦牛（GenBank Accession No:NC_006380）mtDNA D-loop區(qū)序列信息設(shè)計引物，成功擴增出黑山羊mtDNA D-loop區(qū)序列。

該基因長度為1 214～1 224 bp。堿基含量也與其他羊類相近，A+T含量59.8%顯著高于G+C含量40.2%。表現(xiàn)出一定堿基偏好性，A+T含量高是基因非編碼區(qū)普遍特征[2]，顯示GC→AT突變方向。

衡量一個群體mtDNA遺傳變異程度指標(biāo)，Nei定義是給定群體內(nèi)兩個隨機選取mtDNA序列間平均每個位點核苷酸差異數(shù)目（歧義度），該值越小，說明群體遺傳多樣性越低[6]。本次研究測得9個黑山羊類群間核苷酸歧義度在0.287%～3.175%間變化，與李祥龍[7]和苗永旺[8]等對我國地方山羊遺傳多樣性及遺傳背景研究相似。驗證了David[9]、Gordon[10]研究結(jié)果。而總核苷酸歧義度為3.5%，表明群體內(nèi)遺傳變異大于群體間遺傳變異，說明黑山羊群體遺傳變異主要存在于種群內(nèi)部；樂至黑山羊群體內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)較其他8個黑山羊群體大，說明樂至黑山羊群體內(nèi)遺傳變異程度較其他群體高，遺傳純度相對較低；米易黑山羊遺傳多樣性指數(shù)最小，說明在其自選過程中遺傳變異程度較低，種質(zhì)均勻性較好，遺傳純度較高，此結(jié)論與陳明華等[11]研究結(jié)果相一致，也與“大多數(shù)異交動植物遺傳變異主要存在于群體內(nèi)部，而自交生物遺傳變異則主要存在于群體間”定律[12]相符合。也同金鑫燕等從地理范圍、mtDNA和微衛(wèi)星DNA等多個層次上對黑山羊群體遺傳多樣性研究結(jié)果基本一致[13-16]。也許是由于不同物種核內(nèi)基因組遺傳分化有不同機制或者是受不同因素影響所致。本研究認為，黑山羊由于分布地區(qū)自然環(huán)境和社會生態(tài)環(huán)境條件相似或不同，在自然選擇與人工選擇作用下，黑山羊群體遺傳結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生一些變異，部分群體形成比較豐富的遺傳多樣性，而部分群體變異程度較小。這是山羊養(yǎng)殖持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，也可為四川山羊品系劃分提供理論依據(jù)。

根據(jù)9個黑山羊類群遺傳距離結(jié)合分析系統(tǒng)發(fā)育樹，LZ與JT遺傳距離比LZ與JC遺傳距離更近，這與四川農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)羊研究室對樂至黑山羊mtDNA分子遺傳特性研究結(jié)果相同。同時與王杰、郭鵬燕等對四川9個黑山羊群體DNA指紋分析[17]和RAPD標(biāo)記研究得出結(jié)論相符。而9個類群黑山羊明顯劃分為A、B、C支系。由此可見，黑山羊起源并非單源，幾種不同野生黑山羊群體參與黑山羊馴化，由于mtDNA只揭示母系參與馴化，但并不能確定參與馴化母系個數(shù)，本試驗支持山羊多元起源觀點[18-19]。

本研究首次對攀枝花本地黑山羊mtDNA D-loop區(qū)序列進行克隆測序，并對其基因結(jié)構(gòu)進行初步分析，填補本研究領(lǐng)域空白。本研究可為從分子水平上探究黑山羊線粒體基因組遺傳特點、物種進化關(guān)系以及物種多樣性分析等提供科學(xué)參考。

[1] Mirol P M,Peral G P,Vega-Pla J L,et al.Phylogenetic relationships of argentinean creole horses and other south american and spanish breeds inferred from mitochondrial DNA sequences[J].Animal Genetics,2002,33:356-363.

[2] Sambrook J,Fritsch E H,Maiatis T.分子生物學(xué)實驗指南[M].2版.金東雁,黎孟楓,侯云德等,譯.北京:科學(xué)出版社,1998.

[3] 唐懿挺.西藏牦牛mtDNAcytb基因遺傳多樣性及ob基因原核表達[D].成都:西南民族大學(xué),2011.

[4] Gojobori T,Ishii K,Nei M.Estimation of average number of nucle?otide substitutions when the rate of substitution varies with nucle?otide[J].Molecular Evolution,1982,18(6):414-422.

[5] 楊路存.幾種鼢鼠mtDNA D-loop區(qū)序列多態(tài)性與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[6] Zullo S,Sieu L C,Slightom J L,et a1.Mitochondrial D-loop se?quences are integrated in the rat nuclear genome[J].Journal of Molecular Biology,1991,221(4):1223-1235.

[7] 李祥龍.我國主要地方山羊品種遺傳多樣性及其起源分化研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),1997.

[8] 苗永旺,葉紹輝,汪霞等.云南保種乳用圭山羊遺傳多樣性蛋白電泳研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1997,3(12):199-205.

[9] David E,MacHugh,Daniel G.Livestock genetic origins;Goats buck the trend[J].Proceedings of the National Academy of Scienc?es,2001,98:82-84.

[10] Gordon L,Ludovic G,Laurent E,et a1.Multiple maternal origins and weak phylogeographic structure in domestic goats[J].Proceed?ings of the National Academy of Sciences,2001,98:5927-5932.

[11] 王杰,陳明華,華太才讓等.四川9個黑山羊品種（群體）微衛(wèi)星DNA多態(tài)性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2006,37(11):1124-1129.

[12] 盛志廉,陳瑤生.數(shù)量遺傳學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1999.

[13] Gordon L,Ludovic G,Laurent E,et al.Multiple maternal origins and weak phylo geographic structure in domestic goats[J].PNAS,2001,98:5927-5932.

[14] 金鑫燕.10個山羊品種（群體）mtDNA D-loop序列多態(tài)性與成都麻羊MSTN基因克隆測序研究[D].成都:西南民族大學(xué),2003.

[15] 馬正花.四川8個山羊品種（群體）AFLP遺傳多樣性研究[D].成都:西南民族大學(xué),2007.

[16] S.Sultana,Mannen H,S.Tsuji.Mitochondrial DNA diversity of Pakistani goats[J].Animal Genetics,2003,34:417-421.

[17] 王杰,郭鵬燕,王永,等.四川9個地方黑山羊品種(群體)DNA指紋分析[J].四川畜牧獸醫(yī),2005,32(10):27-28.

[18] Joshi M B,Rout P K,Mandal A K,et a1.Phylogeography and ori?gin of Indian domestic goats[J].Molecular Biology and Evolution,2004,21:454-462.

[19] Vila C,Seddon J,Ellegren H.Genes of domestic mammals aug?mented by baekerossing with wild ancestors[J].Trends in Genetics,2005(21):214-218.