鄭春姬，俞 星,2，韓春姬,2,*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)食品研究中心，吉林 延吉 133002)

原發(fā)性肝癌成為世界第5個(gè)最常見的惡性腫瘤，在人類癌癥中占5.6%[1]，也是我國最常見的惡性腫瘤之一。盡管目前對(duì)肝癌的主要治療方法采取手術(shù)措施，肝癌死亡率仍很高。因此，研究肝癌發(fā)生早期階段的預(yù)防劑是非常必要的，尤其是選用天然無毒的化學(xué)預(yù)防劑是國內(nèi)外學(xué)者重視的課題。輪葉黨參(Codonopsis lanceolata)又名山海藻，屬于桔?？泣h參屬植物，廣泛分布于中國、韓國、朝鮮、日本等地。輪葉黨參主要是作為山野菜食用，未見任何毒副作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，輪葉黨參提取物具有抗氧化、抗衰老、抗突變、抗腫瘤、抗疲勞以及提高機(jī)體免疫力等作用[2-5]。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明，輪葉黨參提取物具有顯著的預(yù)防化學(xué)性肝損傷的作用[6-7]。最近的研究結(jié)果表明，輪葉黨參經(jīng)活性酵母發(fā)酵后，其抗氧化活性明顯增強(qiáng)[8]，但有關(guān)輪葉黨參對(duì)化學(xué)致癌物二乙基亞硝胺(DEN)的早期肝臟損傷的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討發(fā)酵輪葉黨參皂苷(Codonopsis lanceolata saponin，CLS)對(duì)DEN致小鼠肝臟氧化損傷的保護(hù)作用，以期能為肝癌化學(xué)預(yù)防劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

輪葉黨參采集自長白山。輪葉黨參采用活性酵母發(fā)酵，CLS的制備方法同俞星等[9]的報(bào)道。

雄性SPF級(jí)KM小鼠50只，體質(zhì)量20～22g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供，在本研究室IVC系統(tǒng)中飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

DEN 日本半井化學(xué)藥品株式會(huì)社；正常熔點(diǎn)瓊脂糖(normal melting point agarose，NMPA)、低熔點(diǎn)瓊脂糖(low melting agarose，LMPA) 美國Promega公司；溴化乙啶(ethidium bromide，EB)、二甲亞砜(DMSO)、Triton X-100 美國Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6B型電泳儀 北京市六一儀器廠；CK-43熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；彗星圖像分析軟件(CASP version 1.2.3b1，從http：//casplab.com獲取) 。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理

雄性SPF級(jí)KM小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，然后隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、單純DEN組(隔日腹腔注射DEN 20mg/kg)及CLS高、中、低3個(gè)劑量組(灌胃劑量200、100、50mg/(kg·d)，同時(shí)隔日腹腔注射DEN 20mg/kg)。連續(xù)6周，每天記錄各組體質(zhì)量變化情況。

1.3.2 制備肝細(xì)胞懸液

處死動(dòng)物后取小鼠肝組織，用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，剪碎，加少量PBS液，在勻漿器中將組織研碎。200目銅網(wǎng)過濾，1000r/min離心10min，棄上清液。用冰冷PBS液洗滌細(xì)胞2次，用冰冷PBS液調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為105～107個(gè)/mL。

1.3.3 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

按傳統(tǒng)方法[10]略加修改，用24孔培養(yǎng)板蓋取代載玻片，采用兩層鋪膠法。第1層膠：0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖100μL，待凝固；第2層膠：制備好的細(xì)胞混懸液5μL和0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖45μL迅速混勻后鋪于第1層膠上面，待凝固。鋪膠后迅速移入4℃冰箱，使其凝固。在4℃條件下裂解、解旋、電泳、中和，溴化乙錠染色后盡快在熒光顯微鏡下觀察。以上步驟均避光、低溫操作，避免額外的DNA 損傷。每個(gè)樣品觀察100個(gè)細(xì)胞，顯微攝像拍照，用CASP軟件分析彗星圖像[11]。

1.3.4 肝組織中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活力含量測(cè)定

每只小鼠取200mg左右的肝組織，用冷生理鹽水沖洗、拭干、稱質(zhì)量、剪碎，置玻璃勻漿器中，加冷生理鹽水，勻漿，制成10%的組織勻漿液，4000r/min離心10min，取上清液待測(cè)。SOD、GSH-Px活性及MDA含量測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，體質(zhì)量變化的比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，損傷分級(jí)的比較采用K-W秩和檢驗(yàn)，損傷程度與藥物劑量間的相關(guān)性采用Kendall等級(jí)相關(guān)分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般體征的變化

實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射DEN，同時(shí)灌胃不同濃度的CLS。連續(xù)觀察6周后，所有受試小鼠活動(dòng)正常，均未見毛色、飲食、大小便等異常，無死亡發(fā)生。

2.2 小鼠體質(zhì)量增長的變化

圖 1 各組小鼠體質(zhì)量的變化Fig.1 Change in body weight of mice from different groups

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)第3～5周，單純DEN組小鼠體質(zhì)量增長顯著低于陰性對(duì)照(P＜0.05)，CLS高、中、低3個(gè)劑量組小鼠體質(zhì)量增長與DEN組比較，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第6周，所有實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，表明CLS在DEN引起小鼠體質(zhì)量增長受抑制過程中，未起到明顯的改善作用。

2.3 對(duì)DEN致肝細(xì)胞DNA損傷的影響

表1 輪葉黨參皂苷對(duì)DEN誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of CLS on DNA damage induced by DNE in mouse liver (±s，n=10)

表1 輪葉黨參皂苷對(duì)DEN誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of CLS on DNA damage induced by DNE in mouse liver (±s，n=10)

注：*.與陰性對(duì)照組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)；#.與DEN 組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)；Δ.與CLS 中劑量組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)。表2 同。

組別 尾長/μm彗星長/μm尾矩Olive尾矩 尾DNA/%陰性對(duì)照組12.98±9.6098.60±27.061.82±3.513.23±4.587.81±12.61 DEN組68.02±14.10* 148.54±19.70* 23.06±16.42* 20.61±8.82* 32.91±18.76*CLS低劑量組 50.85±12.49# 140.75±29.68# 14.06±13.36#14.44±9.29#26.93±20.23#CLS中劑量組 48.59±17.63# 123.89±24.93# 11.49±10.19#12.27±7.21#26.95±20.85#CLS高劑量組 42.67±10.04# 117.87±13.64# 11.65±9.15#10.21±5.58#21.97±17.75#

由表1可知，DEN組的彗星實(shí)驗(yàn)5個(gè)指標(biāo)(尾長、彗星長、尾矩、Olive尾矩及尾DNA百分率)均顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05)。高、中、低3個(gè)劑量組的彗星實(shí)驗(yàn)5個(gè)指標(biāo)均顯著低于單純DEN組(P＜0.05)。給予CLS的3個(gè)劑量組彗星尾長、彗星長及Olive尾矩與CLS存在劑量依賴性，但尾矩和尾DNA含量與給藥劑量不呈劑量依賴關(guān)系，提示彗星實(shí)驗(yàn)中用尾長、彗星長及Olive尾矩3個(gè)指標(biāo)代表DNA損傷程度比尾矩和尾DNA含量指標(biāo)更為敏感。

表2 各組DNA損傷等級(jí)比較Table 2 Comparison of DNA damage grades in different groups

由表2可知，單純DEN組DNA損傷等級(jí)與陰性對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)，即DEN組的DNA損傷程度高于陰性對(duì)照組。給予CLS的3個(gè)組DNA損傷程度均低于DEN組，有顯著性差異(P＜0.05)，且給予CLS的各劑量組DNA損傷分級(jí)以Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)為主，單純DEN組的DNA損傷分級(jí)以Ⅲ級(jí)為主，藥物劑量與損傷程度間的相關(guān)系數(shù)τ為－0.403(P＜0.01)。

2.4 SOD、GSH-Px活性和MDA含量變化

由表3可知，DEN組肝組織勻漿中SOD、GSH-Px活性顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.01)；CLS高劑量組肝組織SOD活性明顯高于DEN組，CLS高、中劑量組肝組織GSH-Px活性極顯著高于DEN組(P＜0.01)；并隨著藥物濃度的增高，小鼠肝組織勻漿中GSH-Px活性也隨之增高。DEN組肝組織勻漿中MDA含量極顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)；輪葉黨參總皂苷高、中、低3個(gè)劑量組肝組織勻漿中MDA含量極顯著顯低于DEN組(P＜0.01)，并呈劑量依賴性減少。

表3 各組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較(±s，n=10)Table 3 Comparison of SOD, GSH-Px activity and MDA content in liver tissues of mice from different groups (±s，n=10)

表3 各組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較(±s，n=10)Table 3 Comparison of SOD, GSH-Px activity and MDA content in liver tissues of mice from different groups (±s，n=10)

注：**.與陰性對(duì)照組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；#.與DEN 組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

GSH-Px活力/(U/mg pro)陰性對(duì)照組80.59±9.411.51±0.369.89±0.52 DEN組72.45±3.19** 2.44±0.35**6.72±0.52**CLS低劑量組77.12±6.471.96±0.21##7.24±0.54 CLS中劑量組76.54±3.931.86±0.37##7.58±0.64##CLS高劑量組79.89±5.71##1.48±0.27##8.85±0.82##組別SOD活力/(U/mg pro)MDA含量/(nmol/mg pro)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良的單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的板蓋鋪膠，不易脫片，操作簡便，速度快，耗材用量少；熒光染色均勻，背景清晰無雜質(zhì)，彗星圖片質(zhì)量很高。非常適合于大量樣本的分析。

本研究結(jié)果表明在給予DEN第3～5周，小鼠體質(zhì)量增長明顯低于正常對(duì)照組，給予CLS未能改善體質(zhì)量增長，這可能是本實(shí)驗(yàn)中所采用的DEN劑量在誘發(fā)肝硬變?cè)缙趯?duì)小鼠毒性比較大，以至于CLS對(duì)其體質(zhì)量的影響不能起到明顯的改善作用。但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中看到，DEN模型組和3個(gè)CLS組小鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)第6周時(shí)繼續(xù)呈上升趨勢(shì)，因此對(duì)CLS對(duì)DEN染毒小鼠體質(zhì)量增長的影響有待于今后進(jìn)一步延長給藥時(shí)間，觀察期長期的效果。

DEN被公認(rèn)為自然界的強(qiáng)致癌物，且DEN誘發(fā)小鼠肝癌模型，其特點(diǎn)為誘癌成功率高，肝細(xì)胞所占比例大[12]，且其誘發(fā)的腫瘤多為肝細(xì)胞癌，與人肝細(xì)胞癌相似[13-14]。DEN誘發(fā)大鼠肝癌的過程要經(jīng)過3個(gè)階段，即肝硬變前期(1～8周)、肝硬變期(8～14周)、癌變期(14～20周)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠給予DEN 20mg/kg連續(xù)6周，肝組織抗氧化酶活性顯著下降，過氧化物堆積，肝細(xì)胞DNA出現(xiàn)明顯的損傷，表明以小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?周時(shí)出現(xiàn)肝臟損傷的變化。

DEN在肝細(xì)胞內(nèi)通過細(xì)胞色素CYP2E1亞型代謝而形成活性氧(ROS)，后者對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[16]，ROS與有些細(xì)胞成分(包括脂質(zhì)、蛋白、DNA、碳水化合物、硫醇及其他低分子質(zhì)量抗氧化劑)結(jié)合，引起大分子氧化，最終導(dǎo)致病理改變[17]，進(jìn)入肝癌的啟動(dòng)階段。在DEN誘發(fā)肝癌的早期，如果降低體內(nèi)過多的自由基水平，可以抑制或消除肝癌的啟動(dòng)及發(fā)展。體內(nèi)氧自由基的增加可以引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而引起細(xì)胞核中的DNA受損。MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，能反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。本研究結(jié)果表明，單純給予DEN的小鼠肝細(xì)胞DNA嚴(yán)重受損，而同時(shí)給予CLS的各個(gè)劑量組DNA損傷程度明顯減輕，且呈劑量依賴性，表明在化學(xué)致癌物作用于機(jī)體的早期使用CLS，可以有效控制致癌物的肝癌啟動(dòng)階段，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防肝癌的目的。本研究結(jié)果表明，DEN誘發(fā)小鼠肝癌的早期肝組織MDA水平顯著提高，給予CLS的各個(gè)劑量組MDA水平明顯低于單純DEN組，表明CLS在體內(nèi)通過清除DEN代謝過程中產(chǎn)生的過多的自由基，保護(hù)肝細(xì)胞DNA受損。

SOD是一種廣泛存在于生物體內(nèi)、具有清除氧自由基的功效，能夠平衡機(jī)體的氧自由基，避免體內(nèi)超氧陰離子自由基的過度積累。GSH-Px是一種廣泛存在于體內(nèi)的過氧化物分解酶，能清除體內(nèi)過多的脂質(zhì)過氧化物，因此，SOD和GSH-Px在體內(nèi)協(xié)同作用，防止脂質(zhì)過氧化及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害。本研究結(jié)果表明，給予小鼠腹腔注射DEN的同時(shí)給予CLS，高劑量組的SOD和中、高劑量組的GSH-Px活性顯著的提高，表明CLS保護(hù)SOD和GSH-Px兩大抗氧化酶，清除由DEN代謝過程中產(chǎn)生的過多的自由基和過氧化物，從而保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性，阻止DNA的損傷。

劉婷婷等[8]證明發(fā)酵輪葉黨參乙醇提取物在體外具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，其作用強(qiáng)于未發(fā)酵輪葉黨參， Kim等[3]證明輪葉黨參乙醇提取物和正丁醇提取物在體外實(shí)驗(yàn)中具有很強(qiáng)的還原能力、清除DPPH自由基能力，并認(rèn)為輪葉黨參提取物是直接抗氧化劑。因此，推測(cè)CLS對(duì)DEN誘發(fā)小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用除了通過保護(hù)SOD、GSH-Px酶活性而清除自由基和過氧化物的途徑外，還可能是通過CLS自身的直接抗氧化和清除自由基作用來實(shí)現(xiàn)的。

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