陳 策，圖力古爾*，包海鷹

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

蛹蟲草(Cordyceps militaris (Fr.) Link)又稱北冬蟲夏草，屬子囊菌門(Ascomycota)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)，是本屬的模式種，在我國分布于吉林、內(nèi)蒙古、湖北、安徽、貴州、云南等省區(qū)，為目前研究和開發(fā)較多的蟲草之一，也是常見人工栽培的蟲草[1-2]。大量報道顯示蛹蟲草提取物具有廣泛的藥理活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)靜、抗疲勞等[3-5]。但對野生和人工蛹蟲草的化學(xué)成分的研究不夠深入，因此本實驗對人工栽培蛹蟲草的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)研究，為建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和了解藥理活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品人工蛹蟲草(含有寄主蠶蛹和蛹蟲草子實體)由東北虎藥業(yè)股份有限公司提供；玉米黃素對照品(純度95%，批號144-68-3)，購于北京伊普瑞斯科技有限公司。

甲醇(色譜純) 山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；二級純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司；高效薄層板(Folio de silica gel 60 F254)、硅膠H(200～300目) 青島海洋化工廠；石油醚(分析純) 天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；其他試劑均為分析純 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀(配有：高壓四元泵，在線真空脫氣機，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，光電二級管陣列檢測器) 美國Agilent公司；Q TRAP LC-MS/MS system(配有電噴霧(ESI)接口的線性離子阱質(zhì)譜儀) 美國Applied Biosystems/MDS Sciex公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Finnigan-MAT.LCQ電噴霧質(zhì)譜儀 上海齊羿電子科技有限公司；Bruker AM-400MHz型核磁共振波譜儀 瑞士布魯克公司；Agilent 7890A 5975C型氣-質(zhì)聯(lián)用儀 廣州優(yōu)瓦儀器有限公司；RY-2型熔點測試儀 天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司；VG-Autospec-300型質(zhì)譜儀 上海仁特檢測儀器有限公司。

1.3 提取、分離及鑒定

1.3.1 提取與分離

取干燥的人工蛹蟲草樣品2kg，粉碎后分別采用石油醚、氯仿和甲醇梯度提取，得石油醚層提取物15.6g，氯仿層提取物24.5g，甲醇層提取物33.2g。石油醚層提取物先采用硅膠柱色譜法粗分，以石油醚-乙酸乙酯(體積比10：1、5：1和2：1)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，分別得FrA1(3.2g)、FrA2(4.1g)和FrA3(4.9g)。FrA1經(jīng)硅膠柱色譜(正己烷-乙酸乙酯10：1)反復(fù)純化，得化合物4(15mg)；FrA2先經(jīng)硅膠柱色譜(正己烷-乙酸乙酯體積比5：1)純化后，再采用重結(jié)晶(氯仿)法得化合物5(18mg)；FrA3用硅膠柱色譜(正己烷-乙酸乙酯體積比2：1)純化后，再經(jīng)重結(jié)晶(乙醚)得化合物6(49mg)。氯仿層提取物同樣采用硅膠柱色譜法分離，以二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比20：1、5：1、3：1、2：1和3：2)梯度洗脫，得FrB1(2.2g)、FrB2(1.2g)、FrB3(4.1g)、FrB4(5.4g)和FrB5(2.1g)。其中FrB2以石油醚-乙酸乙酯(體積比60：1)為流動相進(jìn)行硅膠柱色譜純化，得化合物2(12mg)；FrB3以石油醚-乙酸乙酯(體積比20：1)為流動相也進(jìn)行硅膠柱色譜純化，得化合物3(89mg)；對FrB4以二氯甲烷-甲醇(體積比75：1)為流動相進(jìn)一步采用硅膠柱色譜純化，得化合物1(25mg)；FrB5經(jīng)重結(jié)晶(正己烷)得化合物7(28mg)。甲醇層提取物在低溫下靜置72h后，有結(jié)晶析出，將析出的結(jié)晶再經(jīng)95%乙醇重結(jié)晶，得化合物8(50mg)。

1.3.2 化合物1的鑒定方法

紫外-可見吸收光譜法測定：取適量玉米黃素對照品和化合物1分別溶于氯仿，吸取對照品溶液、化合物1溶液各3mL，置于石英比色皿中，以純氯仿溶液作對照，進(jìn)行紫外-可見吸收(340～600nm)掃描，記錄各吸光度。

薄層色譜法測定：取等量化合物1和玉米黃素對照品分別溶于氯仿，分別吸取10μL，點于同一高效薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(體積比3：2)、石油醚-丙酮(體積比2：1)和氯仿-甲醇(體積比50：1)為展開劑展開，取出后晾干，置可見光下檢視。

HPLC-MS/MS法：分別取適量玉米黃素對照品和化合物1，用5mL甲醇溶解，濾膜過濾得對照品溶液與供試品溶液。色譜條件為美國Restek公司PinnacleⅡ C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-水(體積比95：5)，流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫25℃。質(zhì)譜條件為離子化方式ESI(+)，干燥氣溫度350℃，掃描范圍m/z 50～700，干燥氣流速50mL/min，毛細(xì)管電壓5500eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物1

玉米黃素對照品和化合物1的紫外-可見吸收光譜均在波長400～500nm范圍呈1個主峰和1個肩峰。對照品和化合物1的紫外-可見吸收光譜中2個特征吸收峰數(shù)值一致，且化合物1的紫外-可見吸收光譜中2個特征吸收峰數(shù)值(462、491nm)與文獻(xiàn)[6]報道的玉米黃素紫外-可見吸收數(shù)據(jù)基本相同。

圖 1 玉米黃素對照品的EPI質(zhì)譜圖Fig.1 Enhanced product ion (EPI) mass spectrum of zeaxanthin standard

圖 2 玉米黃素對照品的HPLC-MS/MS分析Fig.2 HPLC-MS/MS analysis of zeaxanthin standard

圖 3 蛹蟲草中化合物1的HPLC-MS/MS分析Fig.3 HPLC-MS/MS analysis of compound 1 from Cordyceps militaris

玉米黃素對照品、化合物1在3種展開系統(tǒng)中均呈單一的黃色斑點，且化合物1與玉米黃素對照品的Rf值相同，薄層色譜顯示兩者為同一化合物。

HPLC-MS/MS的多反應(yīng)監(jiān)測結(jié)果見圖1～3。圖1為EPI質(zhì)譜圖，質(zhì)譜分子離子峰為m/z 569.5。玉米黃素對照品多反應(yīng)監(jiān)測的總離子流峰(圖2A)和高效液相色譜峰(圖2C)的保留時間分別為13.31min和13.28min，化合物1多反應(yīng)監(jiān)測的總離子流峰(圖3A)和高效液相色譜峰(圖3C)的保留時間分別為13.51min和13.50min，與玉米黃素對照品的數(shù)據(jù)基本一致；MRM掃描占絕對優(yōu)勢的5對離子峰分別為m/z 135.2、145.2、159.2、218.2、175.3、133.2，玉米黃素對照品和化合物1在HPLC-MS/MS中保留時間分別為13.194min和13.305min時都含有該5個離子對(圖2B和圖3B)。因此，多反應(yīng)監(jiān)測結(jié)果顯示化合物1和玉米黃素為同一化合物。

通過對人工培養(yǎng)蛹蟲草中化合物1進(jìn)行紫外-可見吸收光譜法、薄層色譜法和多反應(yīng)監(jiān)測法測定，化合物1被鑒定為玉米黃素(zeaxanthin)，結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖 4 玉米黃素的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structure of zeaxanthin

2.1.2 化合物2

無色油狀物，EI-MS m/z 653[M+H]+，1H-NMR (400MHz，CDCl3)：δ 5.30～5.38 (2H, m, H-9’, 10’)、4.69 (1H, m, H-3)、2.25 (2H, t, J=7.6Hz, H-2’)、0.90 (3H, d, J=6.4Hz, H-21)、0.88 (3H, t, J=6.4Hz, H-18’)、0.864 (3H, d, J=6.8Hz, H-27)、0.860 (3H, d, J=6.8Hz, H-26)、0.82 (3H, s, H-19)、0.64 (3H, s, H-18)；13C-NMR (100MHz，CDCl3)：δ173.43 (C-1’)、129.97、129.76 (C-9’, 10’)、73.45 (C-3)、56.43 (C-14)、56.28 (C-17)、54.24 (C-9)、44.67 (C-5)、42.59 (C-13)、39.99 (C-12)、39.52 (C-24)、36.78 (C-1)、36.17 (C-10)、36.17 (C-22)、35.79 (C-20)、35.49 (C-8)、34.76 (C-8’)、34.40 (C-2’)、34.09 (C-11’)、32.00 (C-4)、31.91 (C-7)、29.77～29.09 [(CH2)n油酸部分]、28.63 (C-6)、28.23 (C-16)、28.00 (C-25)、27.53 (C-2)、25.08 (C-3’)、24.20 (C-15)、23.84 (C-23)、22.80 (C-27)、22.68 (C-26)、22.55 (C-17’)、21.20 (C-11)、18.66 (C-21)、14.10 (C-18’)、12.22 (C-18)、12.06 (C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道的一致，故確定化合物2為二氫膽甾醇油酸酯。

2.1.3 化合物3

常溫條件下為無色的油狀物，冷藏后變?yōu)榘咨腆w，可溶于石油醚、氯仿等有機溶劑，置于254nm和365nm紫外燈下觀察，無熒光現(xiàn)象，用10% H2SO4溶液和碘顯色后的斑點為紫色，呈拇指狀。EI-MS m/z 856[M]+，1H-NMR(CDCl3，400MHz)：2.28(2H, t, J=7.6Hz)、1.59(2H, m)、1.29(8H, m)、5.30(1H, m)、5.30(1H, m)、2.04(2H, m)、2.04(4H, m)、1.29(10H, m)、1.29(2H, m)、0.87(3H, m)、2.28(2H, t, J =7.6Hz)、1.59(2H, m)、1.29(22H, m)、1.29(2H, m)、0.87(3H, m)。13C-NMR(CDCl3，100MHz)：61.98(C-1)、68.83(C-2)、61.98(C-3)、172.62(C-1’)、34.08(C-2’)、2 4.7 8(C-3’)、3 1.8 3(C-4’～7’)、2 7.1 0(C-8’)、1 2 9.8 8(C-9’)、1 2 7.9 9(C-1 0’)、2 5.5 4(C-1 1’)、127.81(C-12’)、130.04(C-13’)、27.10(C-14’)、31.83(C-15’～16’)、22.49(C-17’)、14.00(C-18’)、1 7 3.0 4(C-1”)、3 3.9 2(C-2”)、2 4.7 8(C-3”)、31.83(C-4”～7”)、27.10(C-8”)、129.88(C-9”)、129.57(C-10”)、27.10(C-11”)、31.83(C-12”～16”)、2 2.6 0(C-1 7”)、1 4.0 0(C-1 8”)、1 7 3.0 4(C-1”’)、33.92(C-2”’)、24.78(C-3”’)、31.83(C-4”’～14”’)、22.60(C-15”’)、14.00(C-16”’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物3為1-油酰基-2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油。

2.1.4 化合物4

淡黃綠色結(jié)晶，m p 1 1 2 ～1 1 4 ℃(丙酮)，溶于氯仿、丙酮。置于3 6 5 n m 紫外燈下觀察，有很強的亮藍(lán)色熒光，1 0%硫酸顯色后呈鮮艷的黃綠色斑點。EI-MS m/z 393[M]+，1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ 6.59(1H, d)、6.01(1H, d)、5.74(1H, s)、5.25(1H, dd)、5.21(1H, dd)、2.48(1H, m)、2.46(1H, m)、2.14(1H, m)、2.12(1H, m)、2.06(1H, m)、1.88(1H, m)、1.85(1H, m)、1.84(1H, m)、1.83(1H, m)、1.79(1H, m)、1.51(1H, m)、1.49(1H, m)、 1.47(1H, m)、1.25(1H, m)、1.07(3H, s)、1.05(3H, s)、1.04(3H, d)、0.99(3H, d)、0.93(3 H, d)、0.8 3(3 H, d)。13C-N M R(C D C l3，100MHz)：δ 199.48(C-3)、164.47(C-5)、156.13(C-14)、134.98(C-22)、134.05(C-23)、132.54(C-7)、124.46(C-6)、124.46(C-8)、122.95(C-4)、55.70(C-17)、44.33(C-9)、43.99(C-13)、42.86(C-24)、39.25(C-20)、36.76(C-10)、35.58(C-12)、34.12(C-1)、34.08(C-2)、33.07(C-25)、27.68(C-16)、25.36(C-15)、21.21(C-21)、19.96(C-26)、19.64(C-27)、18.97(C-18)、18.97(C-28)、17.61(C-11)、16.63(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物4為4,6,8(14),22(23)-四烯-3-酮-麥角甾烷。

2.1.5 化合物5

無色針狀結(jié)晶，mp137～139℃(乙醇)，易溶于氯仿、丙酮。EI-MS m/z 414[M]+。13C-NMR(CDCl3, 100MHz)：δ 140.76(C-5)、121.68(C-6)、71.78(C-3)、56.77(C-14)、56.06(C-17)、50.14(C-9)、45.84(C-4)、42.31(C-13)、39.78(C-12)、37.26(C-24)、36.7(C-10)、36.41(C-1)、33.95(C-22)、31.90(C-7)、31.90(C-20)、31.55(C-8)、29.16(C-2)、29.16(C-16)、28.23(C-11)、26.09(C-15)、24.29(C-23)、23.07(C-27)、21.08(C-28)、19.80(C-21)、19.38(C-19)、19.17(C-25)、18.77(C-29)、12.05(C-26)、11.85(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道β-谷甾醇的數(shù)據(jù)基本一致[10]，鑒定化合物5為β-谷甾醇。

2.1.6 化合物6

白色針晶，mp177～180℃(丙酮)，可溶于石油醚、氯仿等有機溶劑，不溶于甲醇、乙醇等極性大的溶劑。EI-MS m/z 428[M]+。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ 6.49(1H, d, J=8.4Hz)、6.25(1H, d, J=8.4Hz)、5.21(1H, dd, J=15.2,7.6Hz)、5.19(1H, dd, J=15.2, 8.0Hz)、3.97(1H, m)、1.01(3H, d, J=5.6Hz)、0.90(3H, d, J=6.8Hz)、0.88(3H, s)、0.84(3H, d, J=3.6Hz)、0.82(3H, d, J=3.6Hz)、0.82(3H, s)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道麥角甾醇過氧化物的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物6為麥角甾醇過氧化物。

2.1.7 化合物7

白色針晶，能溶于吡啶和熱乙酸乙酯等溶劑，不溶于石油醚等一類極性較小的溶劑。無熒光現(xiàn)象，用10% H2SO4溶液和碘顯色后的斑點為紫紅色。EI-MS m/z 412(M-18)，1H-NMR(CDCl3, 400MHz)：1H-NMR(CDCl3, 400MHz)：δ 5.36(1H, s)、5.22(1H, dd, J=15.3, 7.4Hz)、5.17(1H, dd, J=15.3, 8.0Hz)、4,07(1H, m)、3.63(1H, d, J=5.0Hz)、1.58(3H, s)，1.09(3H, d, J=6.6Hz)、0.93(3H, d, J=6.8Hz)、0.85(3H, d, J=7.2Hz)、0.83(3H, d, J=7.2Hz)、0.60(3H, s)。13C-NMR(CDCl3, 100MHz)：δ 144.02(C-8)、135.37(C-22)、132.20(C-23)、117.56(C-7)、75.79(C-5)、73.70(C-6)、67.73(C-3)、56.02(C-17)、43.78(C-9)、43.50(C-13)、42.83(C-24)、40.37(C-4)、39.51(C-20)、39.24(C-12)、37.16(C-10)、33.09(C-25)、32.91(C-1)、30.88(C-2)、27.89(C-16)、22.89(C-15)、22.06(C-11)、21.11(C-21)、19.94(C-26)、19.64(C-27)、17.59(C-19)、12.33(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道啤酒甾醇的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物7為啤酒甾醇。

2.1.8 化合物8

斜方針狀結(jié)晶(95%乙醇)，mp 166～168℃，易溶于水，不溶于乙醚等極性較小的溶劑。于甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品共薄層，以正丁醇-醋酸-水(體積比4：1：6)展開，用5%高碘酸鉀溶液顯色，再噴0.5%聯(lián)苯胺乙醇溶液，加熱顯色，兩者均顯清晰的白斑，且Rf值相同；同時兩者共熔點不下降，鑒定化合物8為甘露醇。

2.2 石油醚提取物的GC-MS分析結(jié)果

表1 人工蛹蟲草石油醚提取物GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of GC-MS analysis of petroleum ether extract of cultured Cordyceps militaris

用GC-MS技術(shù)分析得到了樣品總離子流色譜圖。各組分的相對含量是以總離子流色譜圖中用峰面積歸一化方法計算而得，對總離子流色譜圖的各峰進(jìn)行色譜掃描后得到質(zhì)譜圖，以人工譜圖解析并結(jié)合有關(guān)質(zhì)譜文獻(xiàn)資料確定各個化學(xué)成分，分析結(jié)果詳見表1。人工蛹蟲草石油醚提取物中脂肪酸含量較多，其中主要為亞油酸(9,12-十八碳二烯酸)，含量為41.949%、反油酸(反9-十八碳烯酸)，含量為27.696%。

3 討 論

3.1 目前已有文獻(xiàn)報道，蛹蟲草中含有麥角甾-4,6,8(14), 22(23)-四烯-3-酮、β-谷甾醇、麥角甾醇過氧化物、蟲草酸(D-甘露醇)等幾種化合物。本研究以梯度洗脫的方法分離純化了以上化合物，與文獻(xiàn)[11]報道的結(jié)果相一致。

3.2 目前對氫化膽甾醇酯衍生物，尤其是和油酸結(jié)合生成的衍生物的生物活性并未見報道，本研究分離得到的二氫膽甾醇油酸酯就是一種氫化膽甾醇與油酸結(jié)合形成的脂肪酸酯。膽甾醇及其衍生物作為動物和真菌中的主要甾體化合物，具有重要的生理功能和生物學(xué)活性[13]。因為它含有一個甾核結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中有一個叫甾核的四元碳骨架，并且環(huán)上還有3個側(cè)鏈，它能夠消除偏振，所以被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、乳化劑和生物制劑等各個方面。而油酸屬于不飽和脂肪酸中的一類烯酸，在蠶蛹油中大量存在，也被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和生物工程等領(lǐng)域。在醫(yī)藥領(lǐng)域，膽甾醇是一種重要的甾體藥物前體，可作為合成甾體激素、VD3和人工牛黃等藥物的原料[14]。另外，蠶蛹中脂肪酸含量十分豐富，尤其以油酸和亞油酸為主，還含有一定量的β-谷甾醇、膽甾醇。油酸有抗癌、降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、降膽固醇作用，可以作為醫(yī)藥中間體使用，而本研究中發(fā)現(xiàn)蛹蟲草石油醚提取物脂肪酸以亞油酸和反油酸為主，根據(jù)文獻(xiàn)[15]，未感染菌的寄主蠶蛹中也富含亞油酸和反油酸，所以人工蛹蟲草中的亞油酸和反油酸主要來自蟲體。本研究首次從人工蛹蟲草中發(fā)現(xiàn)的膽甾醇與油酸結(jié)合生成的二氫膽甾醇油酸酯是否與蛹蟲草的藥用功效有關(guān)或是否是蛹蟲草的特征性成分，值得進(jìn)一步研究。

3.3 玉米黃素是一種極具潛力的色素和抗氧化劑，在食品、養(yǎng)殖和醫(yī)藥化工行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[16-17]，但在真菌中提取得到未見報道，僅兩篇文獻(xiàn)報道蛹蟲草中含有類胡蘿卜素[18-19]，但未純化和結(jié)構(gòu)鑒定。目前只有一篇報道蟲草屬真菌中分離得到了葉黃素[20]，因此本研究從蟲草屬真菌中尋找到功能性天然色素，為進(jìn)一步開發(fā)蟲草提供了參考。

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