葉 慧，張 兵，蔣海偉，程文娟，鄧澤元，胡蔣寧,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

人參為五加科植物人參(Panax ginseng C.A. Meyer)的根，在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，對(duì)人體有滋脾益肺、生津止渴、安神益智、調(diào)榮養(yǎng)衛(wèi)、大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫等功效[1-3]。其中主要有效成分人參皂苷(gingenoside)為固醇類三萜皂苷化合物，約占人參的4%。人參皂苷具有抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗疲勞等作用，其中人參皂苷Rg3效果突出[4-6]。人參皂苷Rg3為四環(huán)三萜皂苷，由日本學(xué)者北川勛在1983年首次從朝鮮紅參中分離出，并鑒定其結(jié)構(gòu)[7]。其抗癌作用主要作用于細(xì)胞的增殖周期的G2/M期，可有效抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂前期蛋白質(zhì)和ATP的合成，使腫瘤細(xì)胞增殖速度減慢[8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷Rg3對(duì)肺癌、胃癌、腸癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞的增殖有良好的抑制作用[9-13]，以及明顯降低B16F17黑色素瘤肺細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功效[14]。同時(shí)，張艷等[14]通過(guò)對(duì)小鼠注入一定劑量的人參皂苷Rg3，延長(zhǎng)了小鼠爬桿時(shí)間，提高疲勞小鼠的肌糖元含量，降低小鼠BUN含量，提高小鼠肌肉組織Na+-K+-ATP酶活力驗(yàn)證了人參皂苷Rg3的抗疲勞作用。然而，日本學(xué)者Hasegawa等[15]對(duì)人參皂苷在體內(nèi)代謝過(guò)程做了大量工作。其研究結(jié)果表明大部分人參皂苷在體內(nèi)代謝過(guò)程中直接排泄掉，有少量的人參皂苷經(jīng)腸內(nèi)菌復(fù)雜的代謝，降解掉側(cè)鏈上若干糖基，降低極性，進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用[16]。國(guó)內(nèi)學(xué)者謝海堂等[17]通過(guò)建立Caco-2細(xì)胞模型，研究人參皂苷Rg3的攝取和代謝機(jī)制也表明其生物利用率較低。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)人參皂苷Rg3的棕櫚酸酸衍生物的合成，分離純化得到較純的產(chǎn)物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，研究其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖的抑制作用，為新的抗腫瘤藥物臨床治療做前期探索性實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

MCF-7細(xì)胞株 美國(guó)ATCC公司。

DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清、非必需氨基酸 美國(guó)Hyclone公司；谷氨酰胺、胰蛋白酶 美國(guó)Sigma公司；人參皂苷Rg3、棕櫚酸酰氯 美國(guó)阿拉丁試劑公司；其余所用試劑均為分析純。

UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Nicolet 5700智能傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent 6538Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 美國(guó)Agilent公司； Bruker 600核磁共振儀 德國(guó)Bruker公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 德國(guó)Hearous公司；SX-40掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 合成

人參皂苷Rg3 432mg、棕櫚酸酰氯302.7mg、稱取K2CO3190.7mg為縛酸劑，以CH2Cl2為溶劑，在40℃條件下加熱攪拌6h，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后，加適量硅膠旋干制樣。

1.2.2 分離純化

取上樣量的15倍的硅膠(200～300目)70℃烘干，以少量無(wú)水Na2SO4以氯仿、甲醇體積比12：1、10：1、8：1為洗脫劑，梯度洗脫。每管接4～6mL，TLC檢測(cè)，合并相同組分，旋干，得到白色化合物2。

1.2.3 鑒定

采用高效液相色譜法，色譜柱：Water C18(3.9mm × 150mm，4μm)，檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm，檢測(cè)柱溫：25℃，流動(dòng)相：85%甲醇和15%水，流速：1.000mL/min，進(jìn)樣量：10μL。紫外全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)(190～550nm)，質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度275℃；離子源溫度200℃；激活電壓1.5V；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1500。紅外光譜檢測(cè)采用KBr壓片制樣。核磁共振檢測(cè)，13C NMR(400MHz，DMSO)。

1.2.4 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[18]做如下改進(jìn)。采用MTT法檢測(cè)，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞加入生長(zhǎng)液(DMEM)稀釋，在計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度約為2×103～2×104個(gè)/mL。取配好的腫瘤懸浮液180μL置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，加入受試藥物20μL(受試藥物用少量的DMSO助溶，用PBS緩沖液稀釋成4個(gè)質(zhì)量濃度，分別為12.5、25、50、100μg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度5孔，陰性對(duì)照為配藥所用相同比例的溶劑和培養(yǎng)基，空白對(duì)照加等體積的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24、48、72h，加入甲瓚15μL，DMEM培養(yǎng)液135μL，37℃溫育4h，去上清液加入150μL DMSO使甲攢溶解，振蕩器搖勻，用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值(OD492nm)。并以相同質(zhì)量濃度梯度的人參皂苷Rg3為陽(yáng)性對(duì)照組，0.1%名稱DMSO溶液為溶劑對(duì)照組。按照下式計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法分離、純化

利用高效液相色譜法分別檢測(cè)Rg3標(biāo)準(zhǔn)品、反應(yīng)后混合物，以及分離純化所得的新化合物，結(jié)果見(jiàn)圖1。人參皂苷Rg3的最大吸收峰為7min左右，而純化后的生成物最大吸收峰為12min左右。根據(jù)理論預(yù)測(cè)，在人參皂苷Rg3分子結(jié)構(gòu)，兩分子伯醇的羥基化學(xué)性質(zhì)較為活潑，有可能與兩分子的棕櫚酸酰氯反應(yīng)，生成酯化物，其分子極性降低。此結(jié)果表明，硅膠柱柱層析分離所得衍生物純度較純，且產(chǎn)物相比人參皂苷Rg3具有較小的極性，符合推測(cè)。

圖 1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC profiles of ginsenoside Rg3, derivatization products and compound A

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

Rg3：13C NMR (DMSO 400MHz)δ：88.15(C-3)、103.16(Glc C-1)、81.30(Glc C-2)、76.82(Glc C-3)、76.39(Glc C-4)、76.82(GlcC-5)、72.47(Glc C-6)、103.85(Glc C-7)、76.50(Glc C-8)、76.82(Glc C-9)、76.08(Glc C-10)、76.82(Glc C-11)、71.96(Glc C-12)。參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行對(duì)比，此化合物為人參皂苷Rg3。

圖 2 化合物A紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectrum of compound A

由圖2可知，化合物A最大吸收波長(zhǎng)為208nm，表明該衍生物具有三萜皂苷類化合物特征吸收。

圖 3 化合物A的紅外吸收光譜Fig.3 IR spectrum of compound A

由圖3可知，化合物A在3884.83cm-1存在－OH伸縮振動(dòng)，2938.92 cm-1存在亞甲基伸縮振動(dòng)，1750.42、1203.48cm-1存在C＝O振動(dòng)，1642.18cm-1存在C＝C振動(dòng)，1078.55cm-1存在O－C－O振動(dòng)，724.29cm-1存在－CH2振動(dòng)。衍生物除仍具有人參皂苷Rg3主要官能團(tuán)外，由1750.42、1203.48cm-1推斷分子結(jié)構(gòu)中含有的羰基，由724.29cm-1推斷其結(jié)構(gòu)中具有長(zhǎng)碳鏈。

圖 4 化合物A質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of compound A

由圖4可知，EIS[M-H]－= 1259.82，又因?yàn)镽g3相對(duì)分子質(zhì)量為785.01，棕櫚酸酸酰氯相對(duì)分子質(zhì)量為274.88，提示Rg3與兩分子的棕櫚酸酰氯發(fā)生取代反應(yīng)。人參皂苷Rg3分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)伯羥基，都位于C3位的葡萄糖末端(圖5)，容易與棕櫚酸酰氯發(fā)生取代反應(yīng)。

由化合物A13C NMR碳譜圖分析可知，13C NMR (DMSO 400MHz) δ：88.84(C-3’)、104.14(Glc C-1’)、81.40(GlcC-2’)、77.71(Glc C-3’)、76.59(Glc C-4’)、77.33(GlcC-5’)、73.05(Glc C-6’)、104.35(Glc C-7’)、76.68(Glc C-8’)、77.82(Glc C-9’)、76.27(Glc C-10’)、77.33(Glc C-11’)、73.27(Glc C-12’)、173.13(Glc C-6’-a)、33.43(Glc C-6’-b)、25.27(Glc C-6’-c)、29.41(Glc C-6’-d)、28.23(Glc C-6’-e)、29.54(Glc C-6’-f)、29.60(Glc C-6’-g)、29.60(Glc C-6’-h)、29.61(Glc C-6’-i)、29.70(Glc C-6’-j)、29.54(Glc C-6’-k)、29.63(Glc C-6’-l)、29.85(Glc C-6’-m)、31.91(Glc C-6’-n)、23.63Glc C-6’-o)、14.25(Glc C-6’-p)、173.14(Glc C-12’-a)。其中，δ=173.13、173.14，提示衍生物結(jié)構(gòu)中含羰基，與紅外光譜結(jié)果吻合，可推斷人參皂苷Rg3骨架上C3以及所連葡糖糖基團(tuán)發(fā)生化學(xué)位移。可以判斷，兩分子的棕櫚酸酰氯取代了C3位葡萄糖基團(tuán)末端羥基中的H。因此，鑒定該衍生物為人參皂苷Rg3棕櫚酸二酯，分子式為C75H134O14，結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖 5 人參皂苷Rg3及其衍生物結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Chemical structures of ginsenose Rg3 and compound A

2.3 對(duì)MCF-7人類乳腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用

MTT法檢測(cè)Rg3衍生物抑制MCF-7細(xì)胞增殖作用，并用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值(OD492nm)，并計(jì)算抑制率IR。

圖 6 人參皂苷Rg3衍生物對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抑制作用 Fig.6 Comparison of the frowth-inhibitory effects of ginsenose Rg3 and compound A on MCF-7 cell line

由圖6可知，藥物作用24、48、72h的半數(shù)抑制率分別為146.68、122.39、101.95μg/mL。人參皂苷Rg3棕櫚酸衍生物能夠有效抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，隨著藥物作用的時(shí)間增長(zhǎng)而增強(qiáng)。與前體化合物人參皂苷Rg3陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較，對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抑制作用無(wú)明顯差別。而空白對(duì)照組中，含有0.1% DMSO的PBS緩沖液對(duì)細(xì)胞株的存活率無(wú)明顯影響。

3 結(jié) 論

通過(guò)棕櫚酸酰氯與人參皂苷Rg3反應(yīng)合成了人參皂苷Rg3脂肪酸衍生物，以不同比例氯仿甲醇為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱柱層析分析純化而得較純衍生物，并通過(guò)高效液相色譜法、UV、IR、核磁共振等手段鑒定其機(jī)構(gòu)。該衍生物增強(qiáng)了人參皂苷Rg3的脂溶性。初步研究了其體外抗腫瘤活性，結(jié)果顯示，該衍生物對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用且具有質(zhì)量濃度與時(shí)間依賴性。為研究人參皂苷前藥提供了有力的實(shí)驗(yàn)條件，但此類人參皂苷衍生物的生物利用率，抗腫瘤活性機(jī)制，以及其他生物活性都有待進(jìn)一步的深入研究探索。

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