冉 玥，焦必寧,*，趙其陽(yáng)，田 玲，蘇學(xué)素，曾朝波

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.農(nóng)業(yè)部柑橘產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)柑橘研究所，重慶 400712；3.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400716)

柑橘有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的感官品質(zhì)，其果實(shí)及果汁是世界消費(fèi)最多的水果產(chǎn)品之一。柑橘果實(shí)中含有大量的類黃酮、類胡蘿卜素、維生素、酚酸等多種生理活性物質(zhì)，還含有幾乎只存在于柑橘屬中的多甲氧基黃酮如川皮苷、桔黃酮等[1]。研究表明類黃酮物質(zhì)具有抗炎活性[2-3]、抗癌作用、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化功能[4]和抗菌[5]等多種生理作用，國(guó)內(nèi)外已有不少相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道將其用于功能食品和功能飼料的生產(chǎn)研究中。此外，類黃酮種類和含量的差異可作為鑒別柑橘產(chǎn)品摻假[6]、品種及原產(chǎn)地識(shí)別的依據(jù)[6-7]。Sentandreu等[8]研究了利用類黃酮組成及其含量并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)判別分析方法可識(shí)別不同種類柑橘汁，結(jié)果顯示，黃芩素與川皮苷含量比例與多甲氧基黃酮總含量可作為區(qū)分不同品種柑橘汁的特征性成分，能夠顯著地將7種柑橘汁區(qū)分開來(lái)。

目前已有不少柑橘類黃酮檢測(cè)的方法報(bào)道，其中普通高效液相色譜法[9-13]為主流的分析方法，還存在分析耗時(shí)長(zhǎng)、測(cè)定的類黃酮化合物種類較少、精確度不高等問(wèn)題。而超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，基于小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)等技術(shù)，具有快速高效、高分離度等特點(diǎn)[14-15]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、藥物中各類物質(zhì)的分析檢測(cè)中。Spácil等[16]比較了高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)和UPLC同時(shí)分離9種類黃酮物質(zhì)的效果，結(jié)果表明，UPLC所用時(shí)間短2.5倍，使用溶劑少5.5倍，而分離度卻高1.7倍。目前國(guó)內(nèi)較少有超高效液相檢測(cè)柑橘中類黃酮的方法報(bào)道。本研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)化樣品前處理方法，確定最佳儀器分析條件，建立超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法同時(shí)測(cè)定柑橘中11種類黃酮物質(zhì)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘樣品均采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院柑桔研究所國(guó)家果樹種質(zhì)重慶柑橘圃。

圣草枸櫞苷(純度97.4%)、柚皮素-7-β-蕓香糖苷(純度95.0%)、新橙皮苷(純度99.9%)、香風(fēng)草甙(純度93.1%)、柚皮素(純度98.2%)、橘黃酮(純度97.1%)、橙皮素(純度94.6%)(標(biāo)準(zhǔn)品) 美國(guó)Chroma Dex公司；甜橙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%) 德國(guó)Phytolba公司；川皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度96.4%) 美國(guó)Sigma公司；橙皮苷(純度93.7%)、柚皮苷(純度97.3%)(標(biāo)準(zhǔn)品) 瑞士Fluka公司；甲醇(色譜純) 德國(guó)CNW Technologies有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC色譜儀(配有PDA檢測(cè)器及Empour工作站) 美國(guó)Waters公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；KQ5200DE超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；超純水器 美國(guó)Millpore公司；0.22μm有機(jī)相針式濾器 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取圣草枸櫞苷、柚皮素-7-β-蕓香糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風(fēng)草甙、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川皮苷和橘黃酮各5.00mg，分別用色譜純甲醇溶解并定容至10.00mL容量瓶中，配成500mg/L標(biāo)準(zhǔn)品的母液備用。

采用逐級(jí)稀釋法用色譜純甲醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 樣品的制備

柑橘果皮樣品：鮮果皮磨細(xì)后備用。準(zhǔn)確稱取制好樣品1.00g于50mL離心管中，加入甲醇溶液10.00mL，50℃條件下超聲處理30min，以10000r/min離心10min，收集上清液，殘?jiān)?0mL提取劑重復(fù)提取兩次，合并上清液定容至50mL，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

柑橘汁樣品：采用手動(dòng)壓榨法制取新鮮柑橘果汁，用雙層紗布過(guò)濾后備用。準(zhǔn)確吸取制好果汁樣品2.00mL置于50mL離心管中，加入10.00mL甲醇振蕩1min，以10000r/min離心10min，分離上清液，殘?jiān)?0mL提取劑重復(fù)提取一次，合并上清液定容至25mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜后待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：A C Q U I T Y U P L C B E H C18分析柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流動(dòng)相：甲醇和0.2%乙酸溶液，采用梯度洗脫；柱溫：35℃；流速：0.3mL/min；定量波長(zhǎng)為283nm和330nm，波長(zhǎng)掃描范圍200～400nm，進(jìn)樣量為3.0μL。以保留時(shí)間結(jié)合光譜掃描圖定性，采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)11種類黃酮(8種黃烷酮和3種多甲氧基黃酮)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行掃描，屬黃烷酮類的圣草枸椽苷、柚皮素-7-β-蕓香糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風(fēng)草甙、柚皮素和橙皮素均在283nm附近有最大吸收峰，而屬于多甲氧基黃酮的橙黃酮在330nm附近有最大吸收峰，川皮苷和橘黃酮在270nm和330nm附近都有最大吸收峰，綜合考慮最終選取283nm和330nm分別作為黃烷酮和多甲氧基黃酮的定量檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 柱溫和流動(dòng)相的選擇

表 1 流動(dòng)相洗脫程序Table 1 Gradient elution program

隨著柱溫升高，色譜柱的柱效增加，分析時(shí)間縮短，但對(duì)目標(biāo)物的分離度有一定影響。綜合考慮確定35℃作為色譜柱分析時(shí)的溫度。

實(shí)驗(yàn)比較不同流動(dòng)相溶液的分離效果，結(jié)果顯示采用乙腈-乙酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，在橙黃酮、川皮苷和橘黃酮出峰處存在較強(qiáng)基線干擾，而使用甲醇-乙酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)可消除基線干擾，因此選擇甲醇-乙酸溶液作為色譜分析的流動(dòng)相體系。對(duì)于11種類黃酮物質(zhì)來(lái)說(shuō)，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，需采用梯度洗脫的方式進(jìn)行分離，經(jīng)優(yōu)化確定梯度洗脫條件如表1所示。在該條件下，11種類黃酮標(biāo)樣和柑橘樣品色譜圖見圖1，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間并結(jié)合待測(cè)化合物的特征吸收波譜進(jìn)行定性。由圖1可以看出，樣品中類黃酮化合物與其他雜質(zhì)分離，各個(gè)物質(zhì)的峰形良好，分離度高。因此本方法適合柑橘中類黃酮化合物的測(cè)定。

圖 1 11種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和柑橘樣品的超高效液相色譜圖(283nm和330nm)Fig.1 UPLC chromatograms of eleven flavonoids and citrus sample at 283 nm and 330 nm

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 柑橘果皮樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

以鮮果皮作為試材，參考文獻(xiàn)[17]方法，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化果皮前處理?xiàng)l件。

單因素試驗(yàn)比較甲醇、70%甲醇溶液、DMF、DMSO、甲醇＋DMF(1＋1)和甲醇＋DMSO(1＋1)等提取劑的提取效果，結(jié)果表明甲醇提取效果最佳。樣品提取溫度、超聲時(shí)間和提取次數(shù)優(yōu)化結(jié)果見圖2，結(jié)果表明，樣品提取溫度50℃、超聲時(shí)間30min、提取3次時(shí)，類黃酮提取量達(dá)最高。

圖 2 提取溫度(A)、時(shí)間(B)和次數(shù)(C)對(duì)果皮中類黃酮提取量影響Fig.2 Effects of extraction temperature (A), time (B) and times (C) on the total contents of flavonoids in peel

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定超聲時(shí)溫度、超聲時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素的最佳組合。分別選取其中的4個(gè)水平：30、40、50、60℃；10、20、30、40min；1、2、3、4次。選擇L16(45)正交表，將3個(gè)因素分別定為第1、2、3列，根據(jù)正交表安排進(jìn)行試驗(yàn)。正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。由表2結(jié)果的直觀分析及表3中對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的方差分析可以看出3個(gè)因素中最佳水平分別為50℃、30min和3次。此外，由極差大小可判定出3個(gè)因素對(duì)提取出類黃酮總量的影響大小為提取次數(shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間，且在置信概率為95%時(shí)，提取次數(shù)對(duì)類黃酮提取量有顯著性影響。另一方面結(jié)果中的兩空列的值可代表因素間的相互作用和實(shí)驗(yàn)中誤差大小，兩列的極差值和偏差平方和的值都較小，表明因素間沒(méi)有相互作用以及誤差很小。

結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果，最終確定果皮中類黃酮的最佳提取條件為樣品經(jīng)甲醇50℃超聲30min，重復(fù)提取3次。這與傳統(tǒng)的浸提[18]或索氏提取法[19]等相比大大縮短了分析時(shí)間。

表 2 類黃酮的最佳提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experiment design and results of orthogonal test for extraction of flavonoids

表 3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance of the test results

2.3.2 柑橘果汁樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

參考果皮處理方法，使用甲醇作為提取劑，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)確定振蕩1min后以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min為前處理方式。實(shí)驗(yàn)比較提取次數(shù)對(duì)總類黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可看出，隨著提取次數(shù)的增加，類黃酮提取總量增加。但對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析后顯示，提取2、3次和4次的結(jié)果間并無(wú)顯著性差異?？紤]實(shí)驗(yàn)成本和環(huán)保方面，選擇提取2次作為果汁的提取方法。

圖 3 提取次數(shù)對(duì)果汁中類黃酮提取總量的影響Fig.3 Effect of extraction times on total contents of flavonoids in juice

2.4 線性關(guān)系和檢出限

在上述色譜分析條件下，測(cè)定一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以測(cè)得的各個(gè)類黃酮物質(zhì)積分峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各類黃酮的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和方法檢出限如表4所示，11種類黃酮的檢出限(RSN=3)為0.005～0.02mg/kg，在各個(gè)類黃酮物質(zhì)相應(yīng)的線性范圍內(nèi)其質(zhì)量濃度與積分峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9993以上。

表 4 11種類黃酮的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 4 Linear range, linear equation, correlation coefficient and the limits of detection (LODs) of the investigated flavonoids

2.5 精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將同一標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以11種類黃酮物質(zhì)的積分峰面積為對(duì)象，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以考察色譜儀器的精密度。結(jié)果表明，各類黃酮的其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)介于0.9%～1.3%，充分說(shuō)明儀器具有較高的精密度。在不同時(shí)間內(nèi)以該方法重復(fù)測(cè)定同一實(shí)際樣品5次，上機(jī)進(jìn)樣量3μL，通過(guò)計(jì)算RSD以考察方法的重復(fù)性，結(jié)果顯示各類黃酮的RSD值為2.3%～4.2%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

表 5 果皮和果汁回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of recovery test

分別對(duì)果皮和果汁樣品進(jìn)行兩個(gè)水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均6次重復(fù)。根據(jù)樣品中各類黃酮物質(zhì)含量確定該種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣加入量，按上述前處理方法及分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果如表5所示，果皮中各類黃酮物質(zhì)的平均回收率在94.6%～100.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～3.7%，果汁中各類黃酮平均回收率在94.5%～101.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～3.9%。結(jié)果表明上述實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高，能應(yīng)用于柑橘中類黃酮物質(zhì)的檢測(cè)分析。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用上述方法對(duì)檸檬、臍橙、南豐蜜橘和砂糖橘4個(gè)樣品的果皮和果汁中類黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表6所示。不同品種柑橘含有類黃酮種類和含量差異較大。檸檬中含有較多的圣草枸櫞苷，臍橙中含有較多的柚皮素-7-β-蕓香糖苷與橙皮苷，而南豐蜜橘和砂糖橘果皮中均含有較多多甲氧基黃酮類。幾種柑橘中均未檢測(cè)出柚皮苷、柚皮素與新橙皮苷且果汁中類黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于果皮中的含量。

表 6 4種柑橘樣品中類黃酮含量測(cè)定Table 6 The contents of flavonoids in four citrus

3 結(jié) 論

建立了快速有效的同時(shí)測(cè)定柑橘樣品中11種類黃酮物質(zhì)方法，11min內(nèi)上述物質(zhì)得到完全分離。該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，檢出限低，能滿足分析要求。11種類黃酮物質(zhì)在線性范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與積分峰面積均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。分析時(shí)間僅為普通液相色譜法的1/4，有機(jī)溶劑消耗較少，既降低了成本又減少了環(huán)境污染?？勺鳛楦涕贅悠分蓄慄S酮常規(guī)檢測(cè)分析方法。

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